Why use cold conditions during protein extraction?

Cold conditions help preserve protein integrity by reducing enzymatic activity and preventing degradation during lysis.

How does protease inhibition improve protein extraction reliability?

Protease inhibitors block cellular proteolytic enzymes, protecting target proteins from degradation and ensuring accurate downstream analysis.

What role does mechanical homogenization play in cell lysis?

Mechanical homogenization ensures complete cell disruption and efficient protein release following detergent-mediated membrane permeabilization.

Why is repeated washing with cold phosphate buffer necessary?

Repeated washing removes residual culture medium that could interfere with lysis buffer efficiency and contaminate protein samples.

What enables downstream analysis of extracted proteins?

The protocol yields a protein-rich supernatant suitable for quantification and detection in assays such as Western blotting or ELISA.

Extracción de proteínas de células neuronales

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurociencia

0 vistas • 1:58 min • July 8th, 2025

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Tome un cultivo celular que contenga células cancerosas neuronales adheridas a un cubreobjetos y manténgalo en condiciones frías.

Retire el medio de cultivo y lave repetidamente las células con tampón de fosfato frío para eliminar el medio residual.

Agregue un tampón de lisis que contenga una baja concentración de detergente no iónico e inhibidores de proteasa.

El detergente no iónico interrumpe la membrana celular para iniciar la lisis.

Mientras tanto, los inhibidores de la proteasa bloquean las enzimas proteolíticas celulares, protegiendo a las proteínas de la degradación enzimática.

A continuación, use un raspador de células para desalojar las células parcialmente lisadas del cubreobjetos.

Transfiera el contenido a un tubo que contenga el tampón de lisis.

En condiciones de frío, use un homogeneizador para lisar mecánicamente las células, asegurando la lisis celular completa y la liberación de proteínas.

Centrifugar el lisado celular.

Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo.

Las proteínas extraídas de las células tumorales neuronales ahora están listas para un análisis adicional.

Para la validación de la expresión de proteínas, 48 horas después de la transfección, coloque las placas de cultivo en hielo y lave las células dos veces con PBS. Trate las células en cada plato con 200 a 400 microlitros de tampón de lisis y use un raspador de células para quitar las células de los cubreobjetos.

Transfiera las células separadas de cada placa a tubos de microcentrífuga individuales y disocie aún más las células con un homogeneizador bajo hielo. Después de un minuto, granular las piezas celulares homogeneizadas por centrifugación.