Aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos

Tome un cultivo de astrocitos y elimine el medio. Agregue un tampón fisiológico e incube en hielo, inhibiendo la endocitosis de las proteínas de la superficie celular.

Incubar con un reactivo de biotinilación que se une a las proteínas de la superficie celular.

A continuación, incube con un tampón de enfriamiento para inactivar cualquier reactivo sin reaccionar.

Agregue un tampón fisiológico frío y separe mecánicamente las células. Transfiera las células, luego centrifugue y deseche el sobrenadante.

Incubar con un tampón de lisis para lisar las células, liberando proteínas intracelulares biotiniladas y no biotiniladas.

Centrifugar, recoger el sobrenadante y separar una fracción con contenido total de proteínas.

Incube la fracción restante bajo agitación con perlas recubiertas de estreptavidina que se unen a proteínas biotiniladas.

Gire hacia abajo las perlas unidas a proteínas de la superficie celular y separe el sobrenadante que contiene proteínas intracelulares.

Lave las perlas bajo agitación para eliminar las proteínas unidas no específicamente, luego centrifugue y deseche el sobrenadante, aislando las proteínas de la superficie celular.

Las fracciones que contienen proteínas totales, intracelulares y de la superficie celular están listas para su análisis.

Para comenzar este procedimiento, retire los cultivos de astrocitos de la incubadora y deseche el medio por aspiración. Lave las celdas tres veces con 4 mililitros de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado.

Retire el CM-PBS por aspiración y, a continuación, pipetee dos mililitros de tampón de biotina en cada pocillo. Incline suavemente los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces, para asegurar una cobertura completa antes de colocar los cultivos en hielo durante 30 minutos.

Luego, retire el tampón de biotina, reemplácelo con cuatro mililitros de tampón de enfriamiento y mantenga los cultivos en hielo durante 10 minutos. A continuación, aspire y reemplace con la misma cantidad del tampón de enfriamiento antes de dejar los cultivos en hielo durante 10 minutos.

Luego, deseche el tampón de enfriamiento y lave las celdas tres veces con 4 mililitros de CM-PBS enfriado. Después de esto, raspe las celdas en un mililitro de CM-PBS enfriado y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.

A continuación, peletizar las células por centrifugación a 100 g durante tres minutos en una microcentrífuga refrigerada a 4 grados centígrados. Después de eso, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis.

Luego, deje las muestras en hielo durante 30 minutos, en vórtice cada cinco minutos. A continuación, centrifugar el lisado a 14.000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados para granular cualquier detergente y materiales solubles. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Ahorre 50 microlitros de lisado y agréguele 25 microlitros de tampón de carga 3x.

Posteriormente, desnaturalícelo calentándolo a 95 grados centígrados en un baño seco. Esta es la fracción de entrada que contiene proteínas de la superficie celular biotiniladas y proteínas citosólicas no biotiniladas. Con una punta de pipeta cortada, transfiera 75 microlitros de perlas de agarosa de estreptavidina al lisado e incube a 4 grados centígrados durante tres horas en un agitador.

Después de eso, granular las perlas de agarosa de estreptavidina por centrifugación a 1.500 g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Ahorre 50 microlitros del sobrenadante y agregue 25 microlitros de tampón de carga 3x. Luego, desnaturalícelo a 95 grados centígrados en un baño de agua o en un bloque calefactor. Esto representa la fracción intracelular y se compone principalmente de proteínas citosólicas no biotiniladas.

Luego, vuelva a suspender las perlas granuladas en un mililitro de tampón de lavado y muévalas durante tres minutos a 4 grados centígrados. Granular las cuentas y desechar el sobrenadante. Repita este proceso cuatro veces más para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas.

Agregue 50 microlitros de tampón de carga diluido a 1x usando tampón de lisis. Libere biotina y estreptavidina de las perlas desnaturalizándolas a 95 grados centígrados. Esta fracción debe contener solo proteínas biotiniladas de la superficie celular.