Aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos

Tome un cultivo de astrocitos y elimine el medio. Agregue un tampón fisiológico e incube en hielo, inhibiendo la endocitosis de las proteínas de la superficie celular.

Incubar con un reactivo de biotinilación que se une a las proteínas de la superficie celular.

A continuación, incube con un tampón de enfriamiento para inactivar cualquier reactivo sin reaccionar.

Agregue un tampón fisiológico frío y separe mecánicamente las células. Transfiera las células, luego centrifugue y deseche el sobrenadante.

Incubar con un tampón de lisis para lisar las células, liberando proteínas intracelulares biotiniladas y no biotiniladas.

Centrifugar, recoger el sobrenadante y separar una fracción con contenido total de proteínas.

Incube la fracción restante bajo agitación con perlas recubiertas de estreptavidina que se unen a proteínas biotiniladas.

Gire hacia abajo las perlas unidas a proteínas de la superficie celular y separe el sobrenadante que contiene proteínas intracelulares.

Lave las perlas bajo agitación para eliminar las proteínas unidas no específicamente, luego centrifugue y deseche el sobrenadante, aislando las proteínas de la superficie celular.

Las fracciones que contienen proteínas to