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Comience con un plato que contenga una matriz de silicio que tenga múltiples canales pequeños conectados a los puertos de entrada y salida.
Inyecte la proteína de prueba con actividad repulsiva a través de la entrada para llenar los canales.
Incube para permitir la adherencia de proteínas en el área del canal, formando zonas de proteínas de prueba, luego lave.
Retire la matriz, cubra el área recubierta con una proteína de control que posea actividad atractiva e incube.
Esto facilita la adherencia de la proteína de control a las áreas vacías entre las zonas de proteína de prueba, creando zonas de proteína de control con un patrón de rayas alternas, luego lavar.
Agregue laminina para cubrir el área rayada, luego lave.
Siembre el área recubierta con una suspensión unicelular de neuronas del hipocampo e incube.
En la zona de proteínas de prueba, las neuronas interactúan con las proteínas, desencadenando señales que hacen que las neuronas se repelizan, inhibiendo su unión.
Por el contrario, las interacciones neurona-proteína en la zona de proteína de control promueven la unión neuronal, apoyando su crecimiento y extensión de axones.
Prepare las proteínas recombinantes marcadas con fluorescencia en PBS. Haga 25 microlitros por cada plato de rayas. Deje que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, para cada plato, cargue una jeringa de calibre 22 con 25 microlitros de proteína diluida e inyéctela a través del pequeño orificio en el costado de la matriz.
Evite la inyección de burbujas de aire en las matrices, ya que perturbarán la unión de sus proteínas a la enfermedad.
Ahora, incube las placas durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular. Después de la incubación, deposite 300 microlitros de PBS en la hendidura superior de cada matriz. Luego, aspire el PBS de un pequeño orificio ubicado en el costado de cada matriz para eliminar todas las proteínas recombinantes no adheridas. No aspire completamente el PBS porque las proteínas se secarán.
Realice este enjuague PBS un total de tres veces. A continuación, retire con cuidado la matriz de cada plato. Luego, agregue inmediatamente unos 100 microlitros de proteína de control sobre toda el área rayada, creando una capa alternativa en cada plato.
A continuación, incube los platos durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Mientras tanto, en hielo, descongele la laminina en PBS a 20 microgramos por mililitro. Después de 30 minutos, lave los platos tres veces con PBS. Luego, cubra cada plato con aproximadamente 100 microlitros de laminina fría y devuelva los platos a la incubadora durante una hora más.
Una hora más tarde, use PBS para lavar los platos tres veces más. Después del tercer lavado, agregue unos 150 microlitros de medio de cultivo a cada plato. Luego, incube los platos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados hasta que se necesiten nuevamente. Cuente las células con un hemocitómetro y reproduzca 10,000 neuronas en 150 microlitros de medios de cultivo en cada placa de rayas preparada. Deposite con cuidado la suspensión para cubrir toda la región de las rayas.