Aislamiento de fibrillas de amiloide a partir de extracto de tejido cerebral

Tome un extracto de tejido cerebral de ratón que contenga proteínas no amiloides y fibrillas amiloides, un agregado de proteínas insoluble.

Agregue sacarosa sólida y mezcle, aumentando la densidad de la solución.

Transfiéralo y centrifugue para separar las proteínas más densas de los desechos.

Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en un tampón de mayor concentración de sacarosa, mezcle y centrifuge.

Recoja la capa superior que contiene algunas fibrillas amiloides en un tubo nuevo, agregue un tampón de lavado y mezcle.

Ahora, deseche la capa intermedia y transfiera el gránulo enriquecido con fibrillas amiloides al tubo que contiene la fracción de la capa superior para un aislamiento máximo.

Centrifugar las fracciones combinadas y desechar el sobrenadante. Agregue un tampón de digestión e incube para degradar exclusivamente las proteínas no amiloides.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Lave el gránulo para eliminar las proteínas residuales digeridas.

Vuelva a suspender el gránulo en un tampón de solubilización a base de sacarosa que contenga detergente que solubilice las proteínas no amiloides restantes.

Centrifugar, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las fibrillas amiloides aisladas.

Comience colocando una región de tejido cerebral recién diseccionada o congelada en un tubo de dos mililitros que contenga de seis a ocho perlas de cerámica y un tampón de homogeneización helado recién preparado. Luego, muela el tejido con un homogeneizador de molino de bolas a 4,000 RPM, con dos ciclos de 30 segundos de pulso de encendido y apagado. Ahora, agregue nueve mililitros de tampón de homogeneización helado al mililitro de homogeneizado de tejido cerebral en un tubo de 15 mililitros y selle con tiras de película de cera de laboratorio.

Para garantizar una solubilización robusta, mantenga el tubo girando durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, agregue sacarosa sólida a la suspensión de extracto de tejido hasta una concentración final de 1,2 moles. Mezclar bien y centrifugar a 250.000 veces g durante 45 minutos a 4 grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en dos mililitros de tampón de homogeneización que contenga 1,9 molares de sacarosa triturando y centrifugando a 125.000 veces g durante 45 minutos a 4 grados centígrados.

Después de la centrifugación, transfiera la capa sólida blanca superior a un tubo nuevo y solubilice en 1 mililitro de tampón de lavado helado pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Dado que el pellet también está enriquecido con fibrillas amiloides, deseche la capa intermedia acuosa y combine el pellet con la capa superior para obtener un mayor rendimiento. Centrifugar las fracciones combinadas a 8.000 veces g durante 20 minutos a 4 grados centígrados.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de tampón de digestión helado e incube a temperatura ambiente durante tres horas en un vórtice. Centrifugar la muestra nuevamente, luego, lavar el gránulo dos veces en 1 mililitro de tampón Tris helado y centrifugar nuevamente. Después del segundo lavado, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de tampón de solubilización pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y centrifugue rápidamente el tubo a 200.000 veces g durante 60 minutos a 4 grados centígrados.

Guarde el gránulo, luego, reduzca la concentración de sacarosa de 1,3 a 1 molar agregando 50 milimolares de tampón Tris al sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante nuevamente, luego, disolver ambos gránulos en 100 microlitros de tampón Tris que contienen 0.5% SDS. Para la purificación de amiloide, solubilice los gránulos ricos en amiloide mediante ondas de ultrasonido en un dispositivo de sonicación en baño durante 20 ciclos. Luego, centrifugue inmediatamente el material a 20,000 veces g durante 30 minutos a 4 grados centígrados.

Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón SDS Tris al 0,5% y repita el lavado cuatro veces más. Después del paso final de centrifugación, lavar el pellet en 200 microlitros de agua ultrapura y centrifugar a 20.000 veces g durante 30 minutos a 4 grados centígrados para eliminar cualquier resto de detergente. Disuelva el gránulo final que contiene fibrillas amiloides purificadas en 100 microlitros de agua ultrapura.