Evaluación de la viabilidad neuronal en un cultivo de neuronas cerebelosas mediante doble tinción
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:38 min. • July 8th, 2025
Comience con una placa de cultivo tratada con un agente antimitótico que inhibe el crecimiento de las células gliales, dejando principalmente neuronas granulares cerebelosas y una pequeña cantidad de células gliales.
Retire el medio y agregue lentamente solución salina tamponada con fosfato frío o PBS para mantener la viabilidad celular.
Reemplace el tampón con una mezcla de tinción en frío e incube.
Esta mezcla contiene diacetato de fluoresceína o FDA, un compuesto no fluorescente, y yoduro de propidio o PI, un tinte fluorescente impermeable a la membrana.
La FDA se difunde en las células, donde la esterasa funcional en las células vivas la convierte en un compuesto fluorescente verde.
La PI ingresa a las células muertas a través de membranas dañadas, se une al ADN y emite fluorescencia roja.
Retire la solución de tinción y agregue PBS frío para evitar que las células se sequen.
Obtenga imágenes fluorescentes para tinciones FDA y PI y una imagen de contraste de fase. Combine las imágenes de la FDA y PI.
Luego compare esta imagen de fluorescencia con la imagen de contraste de fase, que ayuda a excluir las células gliales grandes.
La fluorescencia roja indica muerte neuronal, mientr
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