Evaluación de la viabilidad neuronal en un cultivo de neuronas cerebelosas mediante doble tinción

Comience con una placa de cultivo tratada con un agente antimitótico que inhibe el crecimiento de las células gliales, dejando principalmente neuronas granulares cerebelosas y una pequeña cantidad de células gliales.

Retire el medio y agregue lentamente solución salina tamponada con fosfato frío o PBS para mantener la viabilidad celular.

Reemplace el tampón con una mezcla de tinción en frío e incube.

Esta mezcla contiene diacetato de fluoresceína o FDA, un compuesto no fluorescente, y yoduro de propidio o PI, un tinte fluorescente impermeable a la membrana.

La FDA se difunde en las células, donde la esterasa funcional en las células vivas la convierte en un compuesto fluorescente verde.

La PI ingresa a las células muertas a través de membranas dañadas, se une al ADN y emite fluorescencia roja.

Retire la solución de tinción y agregue PBS frío para evitar que las células se sequen.

Obtenga imágenes fluorescentes para tinciones FDA y PI y una imagen de contraste de fase. Combine las imágenes de la FDA y PI.

Luego compare esta imagen de fluorescencia con la imagen de contraste de fase, que ayuda a excluir las células gliales grandes.

La fluorescencia roja indica muerte neuronal, mientras que la fluorescencia verde significa viabilidad neuronal.

Comience la tinción mezclando diacetato de fluoresceína a una concentración final de 10 microgramos por mililitro y yoduro de propidio a una concentración final de 50 microgramos por mililitro en 10 mililitros de PBS. Mezcle la solución de PI de la FDA en vórtice y colóquela en hielo. Coloque la placa de cultivo en hielo.

Aspire cuidadosamente el medio de cultivo sin tocar las células con la punta de la pipeta. Luego, agregue lentamente PBS frío. Aspire el PBS, luego agregue la solución de trabajo fría FDA PI o FDA PI Hoechst. Pon el plato en hielo durante cinco minutos. A continuación, después de aspirar la solución de trabajo FDA PI o FDA PI Hoechst, agregue PBS frío a cada pocillo.

Asegúrese de que el microscopio fluorescente esté configurado correctamente. Detecte las emisiones de fluorescencia para FDA PI y Hoechst a 520, 620 y 460 nanómetros, respectivamente, utilizando un tiempo de exposición entre 100 y 300 milisegundos y una ganancia analógica de 2,8X. Después de recopilar imágenes de fluorescencia, tome una imagen con luz normal utilizando el modo de contraste de fase.

Para la doble tinción PI de la FDA, superponga las imágenes de las células arrastrando la capa positiva de la FDA sobre la capa positiva de PI en el software de edición de gráficos. Ajuste la opacidad de la capa positiva para la FDA introduciendo el 50% en el campo de opacidad del panel Capas. Combina dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Fusionar visible. Establezca el contraste de las imágenes superpuestas introduciendo 50 en el campo de contraste en Imagen, Ajustes, Brillo/Contraste. Verifique que no haya células dobles positivas FDA y PI en las imágenes superpuestas.

Para la tinción triple de PI Hoechst de la FDA, superponga las imágenes de las células, nuevamente, arrastrando la capa positiva de la FDA sobre la capa positiva de PI, ajustando la opacidad de la capa positiva de la FDA y fusionando las imágenes como antes. A continuación, arrastre la capa positiva de Hoechst en la capa combinada.

Ajuste la opacidad de la capa Hoechst-positive introduciendo 50% en el campo de opacidad del panel Capas, y combine las dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Fusionar visible. Distinga visualmente las células gliales grandes e irregulares de las neuronas granulares cerebelosas comparando las imágenes tomadas en modo fluorescente con las tomadas en modo de contraste de fase.