Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

Coloque cerebros de Drosophila mutantes y de tipo salvaje en una solución que contenga un fijador y un detergente. Incubar con un balanceo suave.

El fijador preserva la morfología del tejido, mientras que el detergente permeabiliza las membranas celulares.

Deje que los sesos se asienten, luego retire la solución.

Lave los pañuelos con un tampón.

Agregue una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Retire la solución y agregue anticuerpos primarios dirigidos a una proteína específica que regula el desarrollo axonal en las neuronas del cuerpo del hongo del cerebro, o MB.

Incubar para promover la unión de anticuerpos.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los anticuerpos primarios.

Lavar nuevamente para eliminar los anticuerpos no unidos, luego volver a suspender los cerebros en un medio de montaje.

Monte los cerebros en un portaobjetos de puente y visualícelos bajo un microscopio de fluorescencia.

En comparación con el tipo salvaje, los cerebros mutantes exhiben un fenotipo defectuoso, con proyecciones erróneas axonales y lóbulos MB faltantes.

Bajo el microscopio, use una pipeta P200 para transferir de 10 a 15 cerebros disecados en el mismo genotipo a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros lleno de paraformaldehído al 4% diluido en PTN. Luego, incube los cerebros durante 20 minutos con balanceo lento a temperatura ambiente. Después de la fijación, deje que los cerebros se asienten en el fondo del tubo, luego retire el fijador.

A continuación, realice dos lavados rápidos con 500 microlitros de PTN por lavado. Intercambie el PTN tan pronto como los cerebros se asienten en el tubo. A continuación, realice tres lavados largos con PTN utilizando una agitación suave a temperatura ambiente.

Después de estos lavados, los cerebros pueden almacenarse durante la noche a 4 grados Celsius en PTN. Después de retirar el último lavado PTN, incube los cerebros en 0,5 mililitros de solución de bloqueo durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente y con agitación suave. Después de retirar la solución de bloqueo, agregue los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo e incube los cerebros a 4 grados centígrados durante dos días con una agitación suave.

Retire el anticuerpo primario con el régimen de lavado PTN de 5 lavados y luego aplique los anticuerpos secundarios. Deje que estos anticuerpos se incuben con los tejidos durante tres horas a temperatura ambiente mientras están protegidos de la luz con balanceo.

Después de incubar los cerebros en la solución de anticuerpos secundarios, aplique el regimiento de lavado PTN, cubriendo las muestras con papel de aluminio después de cada lavado, y termine eliminando la mayor cantidad de tampón posible. A continuación, agregue 75 microlitros de medio de montaje fluorescente antidecoloración y haga fluir el cerebro y el medio dentro y fuera de la punta de la pipeta solo una vez. Luego, el tubo se puede envolver en papel de aluminio y almacenar a 4 grados centígrados durante varios días, pero idealmente, proceda directamente con el montaje.

Para montar los cerebros, construya un tobogán puente. Coloque dos cubreobjetos de base a aproximadamente 1 centímetro de distancia en un portaobjetos cargado positivamente. Asegúrese de que la corredera cargada positivamente esté boca arriba. Luego, adhiera los cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas y deje que el esmalte se seque por completo antes de continuar.

A continuación, coloque el portaobjetos bajo un microscopio estereoscópico y pipetee los cerebros y el medio en el espacio entre los cubreobjetos. Asegúrese de ajustar la iluminación para mejorar la visualización de los cerebros.

A continuación, aspire el medio de montaje adicional del portaobjetos teniendo cuidado de evitar los cerebros. Luego, elimine el exceso de medios de montaje restantes. Esto permitirá que los cerebros se posicionen con mayor precisión.

Ahora, usando fórceps, oriente los cerebros en un patrón de cuadrícula con sus lóbulos antenales hacia arriba. Luego, coloque un cubreobjetos sobre los sesos y use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos superior que están unidos a los cubreobjetos de la base. Ahora, cargue la cavidad central con medios de montaje nuevos gota a gota, permitiendo que los medios se arrastren debajo del cubreobjetos por acción capilar. Cuando la cavidad esté llena, séllela completamente con esmalte de uñas transparente.