Tinción de inmunofluorescencia para la visualización de células madre neurales proliferadas en secciones de cerebro de ratón

Tomemos secciones fijas de cerebro de ratón que contienen células neurales, incluidas las células madre neurales proliferadas etiquetadas con EdU, un análogo de la timidina.

Delinee las secciones con una marca hidrofóbica para evitar la propagación de la solución.

Agrega un detergente para permeabilizar el tejido. Lavar para eliminar el exceso de detergente.

Agregue un fluoróforo para etiquetar el EdU. Retire el exceso de fluoróforos.

Usando un microscopio de fluorescencia, confirme la tinción adecuada de las células marcadas con EdU.

Aplicar un tampón de bloqueo que contenga proteínas para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos. Retire el exceso de proteínas.

Incubar con anticuerpos primarios que se unen a proteínas específicas en células madre neurales. Retire los anticuerpos no unidos.

Agregue anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo para unirse a los anticuerpos primarios. Lave los anticuerpos no unidos.

Tiñe los núcleos con un tinte y elimina el exceso de tinte.

Retire la marca hidrofóbica, aplique los medios de montaje y coloque un cubreobjetos.

Con un microscopio confocal, observe las secciones para visualizar las células madre neurales marcadas.

Para teñir las secciones de tejido con un análogo de timidina, retire las secciones de tejido del tampón de citrato. Deje que las secciones de tejido se sequen y se adhieran completamente a los portaobjetos antes de dibujar un borde con un bolígrafo hidrofóbico. A continuación, permeabilice las secciones con tampón de permeabilización durante 20 a 30 minutos. Lave las secciones dos veces con TBS Triton durante 5 minutos cada vez. Luego, prepare una solución de reacción EdU.

Incube las secciones en una solución de reacción EdU durante 30 minutos a una hora. Posteriormente, lávelos tres veces en TBS Triton durante 5 minutos cada vez. En esta etapa, verifique si la reacción de EdU funciona usando un microscopio fluorescente. Se deben observar las células marcadas con EdU si la reacción funciona. Ahora, bloquee las secciones de tejido montadas utilizando un tampón de bloqueo criado en el mismo animal que el anticuerpo secundario durante 30 minutos a una hora. Luego, lávelos dos veces en TBS Triton durante 5 minutos cada vez.

Durante el paso de bloqueo, prepare la solución de anticuerpos primarios mezclando el anticuerpo primario en tampón de bloqueo. Posteriormente, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios por portaobjetos para asegurarse de que las secciones de tejido estén completamente sumergidas e incubarlas durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, lave las secciones de tejido tres veces en TBS Triton durante 5 minutos cada una para eliminar el exceso de anticuerpos primarios.

Luego, incube las secciones de tejido en un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo preparado en una solución tampón bloqueante durante dos horas a temperatura ambiente. Lave las secciones de tejido tres veces en TBS Triton durante 5 minutos cada una para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. A continuación, aplique una solución DAPI de 300 micromolares de 1 a 100 en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave las secciones de tejido tres veces en PBS durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de DAPI y retire el círculo de la pluma PAP alrededor del tejido con un hisopo de algodón. Deje que las secciones se sequen antes de aplicar los medios de montaje y cubrirlas con cubreobjetos.