Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:51 min. • July 8th, 2025
Tome cultivos microgliales en una placa de pocillos múltiples que contenga medios.
Reemplace la mitad de los medios en el pocillo de prueba con medios que contengan nanopartículas de plata y en el pozo de control con medios del vehículo. Incubar.
La microglía internaliza las nanopartículas, se activa y libera citoquinas proinflamatorias.
Transfiera los medios del vehículo y los medios acondicionados que contienen estas citocinas a filtros instalados en tubos de recolección.
Centrifugar para eliminar las nanopartículas, reteniendo las citoquinas.
Invierta los filtros en nuevos tubos de recolección, centrifugue y recoja el medio. Agregue medios nuevos.
A continuación, tome cultivos neuronales hipotalámicos.
Reemplace la mitad de los medios del pozo de control con medios del vehículo y los medios del pozo de prueba con medios acondicionados. Incubar.
Las citocinas se unen a los receptores de las neuronas hipotalámicas, activando vías de señalización que inducen la muerte neuronal.
Agregue resazurina e incube.
En las células vivas, las enzimas deshidrogenasas reducen la resazurina débilmente fluorescente a resorufina fluorescente.
Mida la fluorescencia.
La fluorescencia reducida indica un aumento de la muerte neuronal hipotalámica, lo que sugiere neurotoxicidad inducida por nanopartículas.
Para comenzar, recolecte 200 microlitros de medio sobrenadante de cada pocillo de placa y cárguelo en un filtro que eliminará las nanopartículas, colocado sobre un tubo de microcentrífuga.
Es importante recordar que al filtrar las nanopartículas, su tamaño, forma y concentración afectarán la eficiencia de filtración, por lo que es recomendable probar la filtración de antemano.
Ahora, gire los tubos a 14,000 g a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, deseche el flujo continuo, que contiene las nanopartículas, y coloque los filtros boca abajo en nuevos tubos de recolección. Gire los filtros boca abajo a 1.000 g durante dos minutos para recolectar un medio concentrado y acondicionado que contenga citoquinas.
A continuación, aumente el volumen de la recolección a 400 microlitros con DMEM suplementado recién hecho y almacene los tubos en hielo. Para este ensayo, establezca células hipotalámicas a partir de existencias congeladas utilizando los mismos métodos descritos para establecer cultivos microgliales. En última instancia, utilícelos para sembrar placas de fondo transparente y paredes negras con 5,000 células por pocillo en 200 microlitros de DMEM suplementado.
Después de 24 horas de cultivo, retire 100 microlitros de medio y reemplácelo con 100 microlitros de medio filtrado y concentrado recolectado de los cultivos de células microgliales activadas. Luego, incube la placa durante 24 horas en condiciones estándar. Al día siguiente, agregue 22 microlitros de reactivo de resazurina a cada pocillo y continúe la incubación durante 20 minutos. Luego, con un espectrofotómetro multimodo, tome una medida de fluorescencia para estimar la viabilidad de la célula en términos de unidades de fluorescencia relativas.