Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:46 min. • July 8th, 2025
Tome criosecciones de tejidos craneofaciales embrionarios de ratón fijos que comprenden células de la cresta neural.
Lave las secciones en un tampón que contenga un detergente no iónico para eliminar el medio de inclusión y permeabilizar las membranas, permitiendo el acceso a los objetivos intracelulares.
Agregue una solución de bloqueo para saturar los sitios de unión no específicos.
Retire el exceso de solución de bloqueo. Luego, incube con anticuerpos primarios dirigidos a antígenos nucleares, como factores de transcripción y marcadores de proliferación.
Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.
Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para unirse a los anticuerpos primarios unidos al antígeno.
Retire los anticuerpos no unidos usando tampón.
Agregue un medio antidecoloración con un tinte nuclear fluorescente y cubra con un cubreobjetos.
El tinte tiñe los núcleos y el medio antidecoloración protege las señales fluorescentes durante la obtención de imágenes.
Tome imágenes de las secciones bajo un microscopio de fluorescencia para evaluar la expresión y localización de marcadores nucleares, lo que indica la proliferación de células de la cresta neural y la actividad de señalización.
Enjuague los portaobjetos en PBST al 0,1% tres veces durante cinco minutos cada uno, para lavar la OCT y permeabilizar las secciones. Agregue 200 microlitros de solución de bloqueo a cada portaobjetos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, retire la solución de bloqueo sin enjuagar el portaobjetos. Agregue 100 microlitros de anticuerpo primario diluido en solución bloqueante a cada portaobjetos e incube durante la noche a 4 grados centígrados.
Enjuague los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante e incube durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. Enjuague en PBS tres veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente, aún protegido de la luz. Para montar las diapositivas, agregue dos gotas de medio antidecoloración con DAPI en cada diapositiva. Cubra con un cubreobjetos y guárdelo a 4 grados centígrados hasta que esté listo para la imagen.