Evaluación de la integridad estructural de las uniones neuromusculares del músculo longitudinal dorsal en Drosophila

Comience con Drosophila thoraces transgénicos y de tipo salvaje fijados químicamente en un amortiguador.

En los torácicos transgénicos, las uniones neuromusculares de los músculos longitudinales dorsales contienen neuronas que expresan una proteína mutante que induce la neurodegeneración.

Retire el tampón y congele rápidamente los tóralos para evitar daños tisulares durante la bisección.

Agregue un tampón nuevo y transfiera los tóracos a los platos de disección.

Coloque un tórax ventral hacia arriba y retire los grupos de células nerviosas para exponer la línea media.

Divida a lo largo de la línea media para obtener hemitórax.

Retire el exceso de tejido.

Incube los hemitócados en un tampón de bloqueo para permeabilizar las membranas y evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos dirigidos a una glicoproteína expresada en neuronas NMJ y filamentos de actina muscular.

Eliminar los anticuerpos no unidos.

Coloque los hemitórcados en un portaobjetos de puente, agregue medios de montaje y monte los pañuelos.

Visualice bajo un microscopio.

En comparación con el tipo salvaje, los mutantes muestran una tinción neuronal reducida, lo que indica neurodegeneración, mientras que los músculos exhiben fluorescencia intacta.

Antes de comenzar las bisecciones, póngase guantes crioprotectores y gafas de seguridad y llene un matraz Dewar con nitrógeno líquido. Use un rompecuchillas para agarrar una hoja de plumas en ángulo y doble la cuchilla para romper una pequeña pieza. Utilice el rompecuchillas para bloquear la cuchilla en su posición y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para retirar todo el PBS de los tubos de muestra.

Use pinzas criogénicas para sumergir los tubos en el matraz de nitrógeno líquido. Después de 10 segundos, use una pipeta Pasteur para agregar aproximadamente 300 microlitros de PBS helado a cada tubo en hielo y coloque un tórax ventral hacia arriba en una placa de disección recubierta de elastómero de silicona de 10 centímetros que contenga PBS helado. Use un par de fórceps sin filo para colocar el tórax y un par fino de fórceps para extirpar algunos de los ganglios torácicos y exponer la línea media del tórax.

Usando la línea media del tórax como guía, use la cuchilla para hacer un corte poco profundo a través de un tercio del tórax y use las pinzas romas para colocar el tórax en un ángulo de 45 grados. Use la cuchilla para cortar directamente por la línea media del tórax para obtener dos hemotóraces y para hacer cuidadosamente uno o dos cortes para eliminar el exceso de tejido sin dañar los músculos longitudinales dorsales. Luego, coloque las muestras de tejido muscular en un tubo de PBS debidamente etiquetado.

Cuando todas las muestras de tórax se hayan dividido, permeabilice los tejidos en tampón de bloqueo durante al menos una hora a 4 grados centígrados. Al final de la incubación, agite la solución de tinte estructural recién preparada y agregue 150 microlitros de la tinción a cada muestra para una incubación de dos horas en un rotador a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la tinción, lave las muestras en PBST y coloque cinco etiquetas de refuerzo apiladas y cortadas por la mitad, separadas por 15 mililitros, en un portaobjetos de microscopio de vidrio.

Use una punta de micropipeta modificada para transferir los torácicos a cada portaobjetos y use una toallita de laboratorio para eliminar cualquier exceso de PBST. Use fórceps para organizar las muestras de modo que los tóraces estén mirando hacia arriba. Cuando las muestras estén correctamente orientadas, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para aplicar 70 microlitros de medio de montaje a cada portaobjetos y cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos. Luego, use esmalte de uñas para cubrir generosamente los bordes exteriores de los cubreobjetos para obtener un sello completo alrededor de cada tejido.