Generación de organoides neuronales dopaminérgicos a partir de células madre embrionarias humanas

Tome células madre embrionarias humanas, o hESC, en un matraz recubierto de matriz extracelular.

Reemplace el medio con un medio de inducción neural e incube, diferenciando las hESC en colonias de células progenitoras neurales, o NPC.

Agregue una solución enzimática para disociar las colonias.

Centrifugar, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en un medio de inducción con factores de crecimiento para apoyar la diferenciación de NPC.

Agregue la suspensión celular en micropocillos de forma piramidal inversa para formar neuroesferas tridimensionales.

Transfiera las neuroesferas a una placa recubierta de matriz extracelular que contenga un medio de diferenciación con factores de crecimiento y moléculas pequeñas. Incubar bajo agitación para promover la diferenciación en neuronas progenitoras dopaminérgicas.

Reemplace el medio con medio de maduración neural y coloque las neuroesferas en un disco de membrana en un inserto de pozo de cultivo, lo que permite la difusión de aire y nutrientes.

Incubar en condiciones estáticas para formar organoides tridimensionales que consisten en neuronas dopaminérgicas maduras.

Estos organoides, que imitan un cerebro en desarrollo, son útiles para estudiar la degeneración de las neuronas dopaminérgicas, una característica de la enfermedad de Parkinson.

Reemplace el medio de células madre utilizado para mantener las características de pluripotencia de las hESCs, con un medio sin suero que contenga un cóctel de inhibición dual de SMAD para iniciar la inducción neural y 10 inhibidores micromolares de ROCK para aumentar la tasa de supervivencia de las células durante el paso al día siguiente. El primer día, prepare la placa de micropocillos con 2,5 mililitros por pocillo de medio sin suero que contenga la misma concentración de inhibidor de ROCK y moléculas duales de inhibición de SMAD.

Para diferenciar las células hacia el patrón ventral del tubo neural, agregue SHH y FGF8 a 100 nanogramos por mililitro y dos agonistas alisados micromolares. Después de agregar el medio, centrifugar la placa a 1.200 veces g durante cinco minutos para eliminar las burbujas de aire de los micropocillos. Una vez que la placa de micropocillos esté lista para usar con medio diferenciador, retire el medio de hESC y lave rápidamente con PBS sin cloruro de calcio y magnesio.

Disociar las colonias en una suspensión unicelular agregando 7,5 ml de solución enzimática recombinante en un matraz T75. Incube las células durante dos minutos a 37 grados centígrados y luego agregue 7,5 de DMEM F-12. Posteriormente, recoger la suspensión celular y centrifugar a 300 veces g durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y cuente las células en el mismo medio utilizado para preparar la placa de micropocillos.

Ajustar el volumen del medio para obtener una suspensión celular, permitiendo formar neuroesferas que contengan 1.000 células por micropocillo, preparando 4,7 millones de células en 2,5 mililitros de medio, y añadiéndolo a los 2,5 mililitros anteriores de medio ya colocados en la placa. Para distribuir correctamente las células en cada micropocillo, agite suavemente la placa y centríquela a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, incube la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas para generar esferas.

El segundo día, enjuague suavemente los micropocillos con medio y transfiera las esferas en una placa de seis pocillos tratada con tejido. Coloque las esferas en rotación a 37 grados centígrados y cambie la mitad del medio con medio nuevo cada dos o tres días. Del día 3 al 13, para mejorar la inducción neural y convertirse en progenitores neurales con una identidad de mesencéfalo, complemente el medio con tres inhibidores micromolares de GSK-3-beta. Divida la muestra en dos nuevas placas de seis pocillos tratadas con tejido para reducir la densidad de la esfera y evitar la agregación de esferas.

El octavo día, comience la maduración neuronal cambiando a un nuevo medio con factores de crecimiento y cambie el medio cada dos o tres días. El día 21, coloque un inserto de placa de cultivo en un pocillo de una nueva placa de seis pocillos y agregue 1,2 mililitros de medio de maduración neural utilizado para la diferenciación de la neuroesfera debajo del inserto de membrana. Luego, deposite la membrana de PTFE en un inserto de placa de cultivo.

Finalmente, para generar el organoide neural, siembre alrededor de 100 neuroesferas en condiciones de interfaz aire-líquido en la membrana de PTFE. Detenga la rotación de este paso y cambie el medio cada dos o tres días hasta que se logre el punto de tiempo de diferenciación requerido.