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Neurociencia
0 vistas • 3:27 min • July 8th, 2025
Tomemos como ejemplo las células madre y progenitoras neurales primarias y las neuronas, que tienen sialoglicoproteínas marcadas por un indicador de ácido siálico.
Agregue paraformaldehído para fijar las células. Eliminar el exceso de paraformaldehído con tampón.
Incube con una mezcla de reacción que contenga sondas químicas a base de biotina, un agente reductor y un catalizador a base de metal.
El agente reductor activa el catalizador, facilitando la biotinilación de las sialoglicoproteínas.
Retire la mezcla de reacción y lave con tampón. Agregue estreptavidina conjugada con fluoróforos para unirse a las sialoglicoproteínas biotiniladas.
Retire la estreptavidina no unida y lave con tampón. Agregue proteínas y un detergente no iónico para bloquear sitios no específicos y permeabilizar las células.
Retire esta solución e incube con anticuerpos primarios dirigidos a proteínas celulares específicas.
Retire los anticuerpos no unidos.
Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo y un colorante fluorescente para unirse a anticuerpos primarios unidos a proteínas y marcar los núcleos.
Eliminar las moléculas no unidas. Lavar con tampón.
Usando microscopía de fluorescencia, obtenga imágenes de las células para visualizar las sialoglicoproteínas fluorescentes y las proteínas celulares.
Primero, retire los insertos de las placas de cocultivo y aspire el medio de cultivo del fondo de los pocillos. A continuación, lave las células neuronales una vez con PBS precalentado. Aspire el PBS de los pocillos y agregue 1 mililitro de paraformaldehído al 4% preenfriado en PBS a cada pocillo.
Fije las celdas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, lave las celdas tres veces con PBS preenfriado. Aspire el PBS y agregue 1 mililitro de tampón I conjugado con biotina recién preparado en cada pocillo. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, aspire el tampón de reacción de los pocillos y lave las células tres veces con PBS. Agregue 1 mililitro de tampón de tinción a cada pocillo de células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, aspire el tampón de tinción de los pocillos y lave las células tres veces con PBS preenfriado. Agregue 1 mililitro de tampón de bloqueo a cada pocillo de células e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire el tampón de bloqueo de los pocillos y agregue 1 mililitro de solución de anticuerpos primarios a cada pocillo. Incube las células durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios de los pocillos. Lave las celdas tres veces con PBS preenfriado. Aspire el PBS de los pocillos y agregue 1 mililitro de anticuerpo secundario a cada pocillo. Incube las células a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, aspire la solución de los pocillos y lave las celdas tres veces con PBS preenfriado.