Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:18 min. • July 8th, 2025
Comience con un portaobjetos de cultivo de pocillos múltiples que contenga neuronas de un embrión de ratón en un medio.
Las neuronas exhiben conos de crecimiento en las puntas de sus axones en crecimiento. Estas estructuras incluyen proyecciones delgadas llamadas filopodios y extensiones en forma de lámina llamadas laminópodos, que consisten en filamentos de actina y microtúbulos, componentes del citoesqueleto.
Tratar los pocillos de prueba con proteína agregada de amiloide-β, o Aβ, y los pocillos de control con una solución vehicular.
En los pocillos de prueba, el Aβ agregado se une a los receptores de membrana, iniciando una señalización aguas abajo que fosforila las proteínas reguladoras del citoesqueleto.
Las proteínas fosforiladas interrumpen los filamentos de actina y los microtúbulos, desestabilizando la integridad estructural del cono de crecimiento y provocando su colapso.
Incube con un fijador para preservar la estructura celular, luego lave las células y móntelas para obtener imágenes.
Con un microscopio, compare las estructuras celulares en los pocillos de prueba y control.
Una mayor incidencia de colapso del cono de crecimiento en las neuronas tratadas con Aβ indica el efecto tóxico de los agregados de Aβ.
Comience este ensayo con al menos una semana de anticipación abriendo un vial nuevo de A-beta-42 de longitud completa obtenido comercialmente y disolviendo el contenido en agua destilada estéril a una concentración de 0,5 milimolares. Incubar a 37 grados centígrados durante siete días para inducir la agregación y la toxicidad. Prepare alícuotas de A-beta-42 agregadas y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta su uso.
En el cuarto día del cultivo neuronal, tratar los pocillos con 100 microlitros de A-beta-42 agregado a 0,5 micromolares o solución vehicular en medio B durante una hora como se demostró previamente. Una vez transcurrida la hora, retire el medio de cultivo e inmediatamente fije las neuronas con paraformaldehído al 4% que contenga sacarosa al 4% en PBS durante una hora a 37 grados centígrados en una placa caliente.
La fijación es principalmente importante ya que mantener la forma de los conos de crecimiento es fundamental para este protocolo.
Después de la fijación, lave las neuronas tres veces con PBS. Luego, después de quitar la cámara, monte las neuronas con un medio de montaje acuoso. Seque el medio de montaje a 4 grados centígrados durante dos a cuatro días. Capture toda el área de cada pocillo con una lente de objetivo seco de 20x en un microscopio invertido.
Capturar y analizar toda el área en cada pozo es importante para evitar la subjetividad.
Clasifique las neuritas más largas de cada neurona en la etapa 3 o 4 como axones. Los conos de crecimiento axonal que carecen de lamellipodios o que poseen menos de tres filopodios se consideran conos de crecimiento colapsados.