Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:59 min. • July 8th, 2025
Tome un portaobjetos de vidrio que contiene una rebanada cortical de tejido cerebral recolectado de un paciente con Alzheimer. El tejido contiene depósitos insolubles de beta amiloide dentro del parénquima y los capilares cerebrales.
Sumerja el portaobjetos en alcohol diluido para eliminar lípidos y sales.
Lavar con alcohol absoluto para deshidratar el tejido, luego aplicar un fijador para preservar la arquitectura del tejido.
Seque al vacío el portaobjetos, eliminando la humedad.
Tratar con vapor de ácido fórmico en un ambiente humidificado para descomponer los agregados de beta amiloide en péptidos solubles más pequeños.
Usando un escáner óptico, genere imágenes de las características estructurales del tejido para interpretar los datos de la espectrometría de masas de imágenes.
Rocíe una solución de matriz sobre la muestra.
Con un espectrómetro de masas, aplique un láser que la matriz absorba para ionizar los péptidos. Luego, un detector los identifica en función de su relación masa-carga.
Analizar los datos para producir imágenes, revelando la distribución de péptidos beta amiloides en el parénquima tisular y los capilares cerebrales.
Para enjuagar las secciones de tejido, sumerja las muestras en 40 a 100 mililitros de etanol al 70% en un frasco de tinción de vidrio durante 30 segundos para eliminar los lípidos endógenos y las sales inorgánicas. Lave las muestras utilizando la secuencia de lavado que figura en el protocolo de texto. Luego, seque las muestras al vacío durante 30 minutos.
Ahora, trate las secciones de tejido con un vapor de ácido fórmico para una mejor ionización de las proteínas beta amiloides del tejido cerebral de la autopsia. Para ello, prepara el horno a 60 grados centígrados y una fuente de vidrio de incubación con 5 mililitros de ácido fórmico 100%. Mantenga la humedad del aire en el plato de vidrio de incubación al nivel de saturación.
Coloque los portaobjetos de tejido en el plato de vidrio de incubación evitando la inmersión en el ácido fórmico y trate durante seis minutos. Tome una imagen óptica de las muestras con un escáner de película, un escáner de gel o un microscopio digital. Realice este paso a temperatura ambiente.
La alineación de la imagen óptica de las muestras es necesaria cuando el objetivo de la muestra se coloca dentro del instrumento. Por lo general, no será posible reconocer la sección de tejido debajo de la capa de matriz. Para correlacionar las imágenes ópticas con las muestras, haga marcas de guía que sean visibles tanto en la imagen óptica como debajo de la capa de matriz en la óptica de la cámara. La forma más fácil es detectar al menos tres marcas de líquido corrector alrededor de la muestra antes de tomar la imagen óptica.
Para rociar la matriz con un rociador ultrasónico, retire el tejido que se rociará del desecador y colóquelo en la cámara. Asegúrese de que el pañuelo no cubra la ventana del sensor. Inicie la preparación pulsando el botón Inicio. Por lo general, el tiempo de preparación es de alrededor de 90 minutos.
La preparación se regulará automáticamente mediante el control del espesor y la humedad de la capa de matriz. Alternativamente, para rociar la solución de matriz en la superficie del tejido con un rociador automático, use un sistema de bomba de solvente configurado a 10 PSI y 0.15 mililitros por minuto para administrar la solución de matriz.
Se suministrará un flujo constante de gas de vaina calentado junto con la pulverización de solución de matriz. Realice experimentos de imágenes de alto rendimiento y alta resolución espacial con MALDI-IMS. Para las mediciones de espectrometría de masas, defina las áreas de tejido utilizando el software de control MALDI y el software de análisis de datos.
Adquiera espectros en un modo lineal positivo con un rango de relación masa-carga de 2.000 a 20.000 y una resolución espacial de 20 y 100 micras. Para hacer el estándar de calibración, disuelva el estándar de calibración de péptidos en el estándar de calibración de proteínas en una proporción de 1 a 4 con CHCA en una solución TA30 y luego, dilúyalo 10 veces.
Coloque 1 microlitro de estándar de calibración en el portaobjetos en cuatro ubicaciones diferentes. Usando software de histología molecular, superponga múltiples imágenes de señales para encontrar la correlación espacial de varias señales, como diferentes péptidos beta-amiloide que se colocalizan en placas seniles en las paredes arteriales.