Detección de microhemorragias cerebrales en un modelo de rata

Las microhemorragias cerebrales, o CMH, son hemorragias cerebrales neuroinflamatorias causadas por la interrupción de la barrera hematoencefálica, lo que resulta en la fuga de glóbulos rojos, o RBC, al tejido cerebral.

Para detectar CMH, comience con tejido cerebral fijo de una rata con CMH.

Sumerja el tejido en sacarosa para crioprotección.

Usando un crio-micrótomo, seccione el tejido y recoja una sección en un portaobjetos de vidrio.

Lave para eliminar el fijador residual.

Aplicar colorante de hematoxilina unido a un catión metálico que interactúa con el ADN cargado negativamente, tiñendo el núcleo de color púrpura rojizo.

Siga con alcohol ácido para eliminar el exceso de tinte, luego aplique un agente azulante alcalino para neutralizar el ambiente ácido y convertir el tinte a su forma azul, mejorando el contraste.

Lave el tejido con alcohol para mejorar la penetración de la mancha, luego aplique eosina para teñir los glóbulos rojos de color naranja y los componentes del tejido de rosa.

Deshidrate el tejido utilizando concentraciones crecientes de alcohol y límpielo con xileno para visualización microscópica.

Capture imágenes para detectar los glóbulos rojos filtrados de color rojo anaranjado, confirmando los CMH.

Después de aislar el cerebro, sumérjalo en sacarosa al 20% en PBS durante al menos seis horas o hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. Cambie la solución a sacarosa al 30% y fíjela durante otras seis horas.

Finalmente, prepare secciones de tejido cerebral de 10 milímetros de espesor con un criostato. Comience la tinción de H&E lavando los portaobjetos en agua destilada. Luego, sumérjalo en una solución de hematoxilina durante ocho minutos. Después de la tinción, lavar con agua corriente del grifo durante cinco minutos. Diferenciar en ácido alcohólico al 1% durante 30 segundos.

Después de lavar con agua corriente del grifo durante un minuto, tiñe con agua con amoníaco al 0,2% o solución saturada de carbonato de litio durante 30 segundos a un minuto. A continuación, lávese con agua corriente del grifo durante cinco minutos. Contramanche con solución de eosina durante 30 segundos a un minuto. Deshidrate con alcohol al 90%, luego alcohol al 95% y alcohol absoluto durante 0.5 a 2 minutos cada uno.

Después de la deshidratación, limpie en xileno durante 30 segundos. Después del montaje, analice la tinción de H&E con un microscopio de fluorescencia de campo claro. Los glóbulos rojos liberados por los vasos sanguíneos, que son componentes de los CMH, aparecen en rojo anaranjado bajo la tinción de H&E.