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Comience con un cubreobjetos que contenga neuronas cultivadas que expresan proteínas de la membrana de la vesícula sináptica, incluida la sinaptofisina y la sinaptotagmina-1 marcadas con fluorescencia.
Retire el medio, agregue una mezcla de tampón de despolarización y anticuerpos primarios, luego incube.
Los iones tampón ingresan a las células, estimulando la fusión de vesículas sinápticas con la membrana, lo que expone la sinaptotagmina-1.
Los anticuerpos primarios se unen selectivamente a la sinaptotagmina-1 expuesta.
Deseche el tampón y lávelo con el medio para eliminar los anticuerpos no unidos.
Introducir medio fresco e incubar para facilitar la internalización de la membrana, formando vesículas recicladas con sinaptofisina marcada y sinaptotagmina-1 unida a anticuerpos.
Retire el medio, fije las células y lávelas.
Introduzca un tampón de bloqueo a base de detergente con anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos.
El detergente permeabiliza las células, permitiendo que los anticuerpos secundarios interactúen con la sinaptotagmina-1 unida a anticuerpos.
Levante el cubreobjetos, lávelo con agua y séquelo.
Coloque el cubreobjetos boca abajo en un portaobjetos con un medio de inclusión para el análisis óptico de las vesículas recicladas con doble etiqueta.
Precaliente 600 microlitros de 1x tampón de despolarización y 10 mililitros de medio de cultivo celular a 37 grados centígrados en el baño de agua. Agregue 1 microlitro de anticuerpo anti-SYT1 de ratón al tampón de despolarización 1x y vórtice durante 10 segundos. Después de retirar y desechar el medio de cultivo celular de las células, agregue 200 microlitros de la mezcla de anticuerpos de despolarización a cada pocillo.
Incube la placa durante 5 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 en la incubadora. Retire y deseche la mezcla de anticuerpos de despolarización y lave las células tres veces con medio de cultivo celular. Agregue 1 mililitro de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Luego, retire 750 microlitros de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Repita este proceso tres veces. A continuación, retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 300 microlitros de PFA al 4% en 1x PBS.
Finalmente, incube durante 20 minutos a 4 grados centígrados antes de lavar tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS. Diluya el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforo en 200 microlitros de tampón de bloqueo para cada pocillo a una dilución de 1 a 1.000. Retire y deseche el PBS 1x de cada pocillo que contenga cubreobjetos con las neuronas cultivadas.
Agregue 200 microlitros de mezcla de anticuerpos tampón de bloqueo a cada pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células tres veces durante 5 minutos con 1 mililitro de 1x PBS.
A continuación, agregue una gota de 7 microlitros de medio de inclusión en el portaobjetos del microscopio. Retire el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantándolo con una cánula y agarrándolo con fórceps. Sumerja el cubreobjetos en agua destilada para quitar el PBS y séquelo cuidadosamente tocando un borde con un tejido blando.
Voltee el cubreobjetos sobre la gota del medio de inclusión de modo que la superficie que transporta las células mire hacia el portaobjetos del microscopio, incrustando así las células en el medio de inclusión. Deje que los portaobjetos se sequen debajo de la campana durante una o dos horas, cubriéndolos para evitar la exposición a la luz. Guarde los portaobjetos secos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 grados centígrados.