JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
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Comience con un cultivo de neuronas adherentes tratado con alfa-sinucleína o agregados alfa-S, que son grupos de una proteína mal plegada.
Estos grupos se agregan para formar inclusiones intracelulares.
Reemplace el medio con una solución de fijación para preservar la integridad celular.
Retire la solución de fijación y lave con tampón.
A continuación, agregue un tensioactivo para permeabilizar la membrana celular.
Retire el tensioactivo y lávelo con tampón.
Introducir una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Ahora, incubar con anticuerpos primarios que se unen específicamente a inclusiones alfa-S y proteínas estructurales.
Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.
Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia.
Eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue una tinción fluorescente para etiquetar el núcleo.
Retire la mancha y lave con tampón.
Usando medios de montaje, monte el cubreobjetos con neuronas en un portaobjetos.
Bajo un microscopio fluorescente, observe inclusiones alfa-S inmunomarcadas dentro de la neurona.
Para realizar inmunofluorescencia en una campana extractora química, fije las neuronas con paraformaldehído al 2% en PBS y solución de sacarosa al 5% durante 15 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después de 15 minutos, retire la solución fijadora y lave brevemente las neuronas con PBS tres veces.
A continuación, permeabilice las neuronas con un 0,3% de tensioactivo no iónico en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave brevemente las neuronas con PBS tres veces. Incube las neuronas con FBS al 3% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbitario para bloquear sitios de unión inespecíficos. Luego, incube las neuronas con el anticuerpo primario apropiado disuelto en FBS al 3% en PBS durante la noche en la cámara frigorífica o el refrigerador durante la noche a 4 grados Celsius en un agitador orbital.
Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave las células brevemente con PBS tres veces. Luego, incube las neuronas con el anticuerpo secundario fluorescente apropiado disuelto en FBS al 3% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital.
Retire la solución de anticuerpos y lave brevemente con PBS tres veces. A continuación, tiñe las neuronas con solución DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital. Después de 15 minutos, retire la solución de anticuerpos y lave brevemente con PBS tres veces. Monte los cubreobjetos en la corredera utilizando un medio de montaje antidecoloración.