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Neurociencia
0 vistas • 3:33 min • July 8th, 2025
Comience con una placa sin fondo de varios pocillos unida a una membrana de silicona. La membrana está recubierta con un biopolímero para facilitar la adhesión celular.
Introducir neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos, o hiPSCN, suspendidas en un medio en los pocillos. El medio se complementa con proteínas de matriz extracelular o ECM para mejorar la adhesión celular.
Incubar la placa, permitiendo que las células se adhieran a las proteínas ECM y al biopolímero, promoviendo una interacción uniforme con la superficie de la membrana.
A continuación, asegure la placa en la etapa de un dispositivo para lesiones.
Usando el dispositivo, aplique una hendidura en la membrana para generar un estrés mecánico controlado en las neuronas.
El estrés interrumpe el citoesqueleto, lo que provoca la degeneración de las protuberancias celulares denominadas neuritas y la formación de pequeñas hinchazones a lo largo de las neuritas.
El estrés también daña la integridad de la membrana celular, lo que resulta en la muerte celular.
Los hiPSCN que exhiben un fenotipo de lesión por estiramiento ahora están listos para su análisis.
Para estirar la placa, cambie el campo "Nombre de archivo" y "Ruta de archivo" en el instrumento virtual "Seguimiento de posición" a un nombre de archivo único y haga clic en la flecha Ejecutar. Establezca la profundidad y la duración de la hendidura en los campos "Lesión" y "Duración de la lesión" en el instrumento virtual del panel de control de movimiento. Con la placa en la posición cero, ejecute el instrumento virtual "Panel de control de movimiento" y haga clic en Lesionar para sangrar la placa.
Haga clic en Top para mover el escenario hacia arriba, haga clic en Stop cuando la placa esté en la posición superior y abra la puerta para desactivar el dispositivo de lesión. Luego, inspeccione el historial de desplazamiento de la etapa presentada en el instrumento virtual "Position Tracker" para confirmar que se aplicó el desplazamiento máximo especificado y exporte los datos a un programa de hoja de cálculo apropiado.
Para evaluar el estiramiento de la membrana de silicona después del tratamiento con plasma, coloque la placa sobre una superficie blanda e imprime la pequeña protuberancia en un sello con tinta de un rotulador permanente. Inserte el sello en el primer pocillo a probar y golpee para asegurar una buena transferencia de tinta. Cuando todos los pozos hayan sido estampados, coloque una cámara de alta velocidad en un soporte de brazo sobre el dispositivo de lesión, con la lente ajustada al número F más pequeño para que el campo de visión contenga 12 penetradores en una cuadrícula de 3 por 4.
Con la placa en la posición de punto cero, haga clic en el botón Grabar en el software de la cámara para que lea "Trigger In" y encienda la luz axial difusa y brillante, luego sangra la placa como se acaba de demostrar y apague la luz axial.
Para dañar un cultivo celular, agregue 100 microlitros de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas tratadas con laminina a cada pocillo de la placa tratada con plasma, y deje que las células se adhieran al fondo de la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente, antes de colocar la placa en la incubadora de cultivo celular. Después de 2 a 3 días de cultivo, sujete la placa en la etapa del dispositivo de lesión y ajuste la posición de la tapa para asegurar la placa sin exponer los cultivos al aire ambiente. Luego, con la placa en la posición del punto cero, sangra la placa como se acaba de demostrar.