JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:30 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células de mamíferos transfectadas.
Estas células expresan el receptor odorante (OR) de la neurona olfativa, un receptor acoplado a proteína G, junto con un biosensor de AMPc que contiene un dominio de unión de AMPc fusionado con una luciferasa mutante.
Retire el medio y lave con tampón para eliminar el medio residual.
Agregue un tampón que contenga un sustrato de biosensor de AMPc. Incubar para facilitar la absorción del sustrato en las células.
Usando un lector de placas de quimioluminiscencia, mida la luminiscencia basal de las células.
Agregue concentraciones crecientes del odorante de prueba a los pocillos, dejando un pocillo sin tratar como control.
El odorante se une al quirófano y desencadena una cascada de señalización que produce AMPc.
Este AMPc se une al dominio de unión del biosensor, activando la luciferasa, que interactúa con el sustrato para emitir luz.
Mida la luminiscencia en tiempo real. Un aumento en la luminiscencia con concentraciones más altas de odorante indica la activación de OR por el odorante.
Antes de la estimulación, observe las células transfectadas bajo un microscopio de contraste de fase para garantizar una confluencia adecuada del 50% al 80% por pocillo antes de regresar a la incubadora. Luego, prepare el medio de estimulación agregando 10 milimolares de HEPES y 5 milimolares de glucosa a la solución salina equilibrada de Hank. Descongele alícuotas de 55 microlitros de alícuotas de reactivos de sustrato de ensayo de AMP cíclico en tiempo real en hielo.
Prepare una solución de equilibrio al 2% mezclando 55 microlitros del reactivo del sustrato y 2.750 microlitros de medio de estimulación. Después de extender una capa gruesa de toallas de papel sobre el banco, golpee suave y repetidamente el plato boca abajo sobre las toallas de papel para que el medio de transfección sea absorbido por las toallas de papel. Lave las células pipeteando 50 microlitros de medio de estimulación en cada pocillo.
Golpee suave y repetidamente el medio de estimulación de la placa de 96 pocillos. Pipetee 25 microlitros de solución de equilibrio al 2% en cada pocillo e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 horas. Antes del final del tiempo de incubación, diluya las soluciones madre odorantes descongeladas a la concentración de trabajo en el medio de estimulación.
Antes de agregar odorante, use un lector de placas de quimioluminiscencia para medir el nivel de luminiscencia basal de la placa. Retire rápidamente la placa del lector de placas y agregue 25 microlitros de las diluciones de odorante a cada pocillo. Luego, comience inmediatamente la medición continua de luminiscencia de todos los pocillos durante 20 ciclos en 30 minutos.