Medición de la activación del receptor odorante mediante un ensayo de monofosfato de adenosina cíclico en tiempo real

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células de mamíferos transfectadas.

Estas células expresan el receptor odorante (OR) de la neurona olfativa, un receptor acoplado a proteína G, junto con un biosensor de AMPc que contiene un dominio de unión de AMPc fusionado con una luciferasa mutante.

Retire el medio y lave con tampón para eliminar el medio residual.

Agregue un tampón que contenga un sustrato de biosensor de AMPc. Incubar para facilitar la absorción del sustrato en las células.

Usando un lector de placas de quimioluminiscencia, mida la luminiscencia basal de las células.

Agregue concentraciones crecientes del odorante de prueba a los pocillos, dejando un pocillo sin tratar como control.

El odorante se une al quirófano y desencadena una cascada de señalización que produce AMPc.

Este AMPc se une al dominio de unión del biosensor, activando la luciferasa, que interactúa con el sustrato para emitir luz.

Mida la luminiscencia en tiempo real. Un aumento en la luminiscencia con concentraciones más altas de odorante indica la activación de OR por el odorante.

Antes de la estimulación, observe las células transfectadas bajo un microscopio de contraste de fase para garantiz