Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

El objetivo general de este procedimiento es detectar ARN mensajeros en neuronas individuales. Esto se logra mediante la fijación de parches y el registro de neuronas individuales, luego aspira completamente el citoplasma de cada neurona registrada del MR.mRNA y el citoplasma. El CD NA se fabrica y amplifica mediante PCR.

En última instancia, los ARNm específicos para los receptores, los canales iónicos y las enzimas se pueden detectar a través de un sistema convencional de imágenes en gel. Mi nombre es y trabajo en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee. Por lo general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades porque la cantidad de resonancias magnéticas en un solo neuro es extremadamente pequeña y se pierde fácilmente.

Comience este protocolo usando un vibrador para cortar cortes de cerebro coronal de 300 micrómetros de grosor que contienen la parte rostral media de la nigra sustancial. Se pueden aislar cerebros de ratas spra dolly de 15 a 40 días de edad. El procedimiento de corte de rodajas se realiza en frío en una solución de corte con alto contenido de sacarosa, oxigenada con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y a un pH de 7,4, incubar las rodajas en líquido cefalorraquídeo artificial y burbujear con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de oxígeno gaseoso.

Mantenga la temperatura a 34 grados centígrados y deje las rodajas allí durante 45 minutos. A continuación, mantenga los trozos de cerebro a temperatura ambiente hasta el registro. Comience transfiriendo un trozo de cerebro a una cámara de grabación de pinza de parche.

Perfundido continuamente con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado a 32 grados centígrados. Llene las pipetas de parche con solución intracelular de autoclave preparada con agua libre de ADN y ARN. Baje una pipeta cargada en la bañera.

Comprueba que la resistencia esté entre dos y tres mega ohmios. Primero, localice al nigra sustancial por su ubicación distinta y anatómica. A continuación, utilizando la óptica namar y un objetivo de 60x, seleccione celdas grandes en la SNC y la SNR para la grabación.

Estas son posibles neuronas dopaminérgicas o GABAérgicas sin dudarlo. Utilice una configuración convencional de celda completa de sello hermético giga para hacer pinzas amperimétricas y pinzas de voltaje. Estos registros generalmente deben realizarse en menos de cinco minutos para minimizar la degradación del ARNm.

En aproximadamente un minuto, es posible proporcionar huellas electrofisiológicas para las neuronas de interés registrando solo sus propiedades de membrana y pico. Después de obtener datos de una neurona de interés, use una succión bucal suave para aspirar el citoplasma. El sello hermético no debe romperse, ya que de lo contrario.

Los desechos extracelulares, incluido el ARNm, pueden ser absorbidos por la pipeta de parche y contaminar el contenido celular. Expulse el contenido de la célula en un tubo de PCR de 0,2 mililitros rompiendo la punta de la pipeta y aplicando una ligera presión positiva. Cuando termine, coloque inmediatamente el tubo en un congelador de menos 20 para descartar la contaminación de desechos extracelulares que puedan contener ARNm.

Realice un control negativo recogiendo el contenido de una pipeta de parche introducida en el tejido sin utilizar ninguna aspiración. Después de recolectar contenido celular de entre 10 y 20 neuronas, comienzan inmediatamente la reacción de transcripción inversa. Para minimizar la degradación de los ARNm, comience por digerir cualquier ADN genómico contaminante con ADN, uno durante cinco minutos, a 25 grados centígrados.

Este paso es fundamental para reducir los posibles falsos positivos y no debe eludirse. A continuación, inactive el ADN con 1,2 microlitros de EDTA de 25 milimolares e incube las muestras a 70 grados centígrados durante cinco minutos. Ahora, use un kit disponible comercialmente para sintetizar CD NA para verificar que el ADN genómico se eliminó por completo.

Ejecute una reacción de control de cada muestra sin transcriptasa inversa. Mientras que todos los demás componentes de la reacción siguen siendo los mismos. Almacene los productos a menos 20 grados centígrados hasta que sean necesarios para el diseño de PCR.

Los cebadores de acuerdo con las secuencias en el banco de generación, siempre que sea posible, hacen una introducción T que abarca reparaciones de cebadores para ayudar a detectar la contaminación genómica del ADN. Para comprobar la eficacia de los pares de cebadores, pruébelos en CD NA de todo el cerebro para la primera etapa. La PCR amplifica cinco microlitros de los CDNA de 30 microlitros durante 35 ciclos utilizando un protocolo de ciclo térmico estándar.

Para la segunda etapa, la PCR amplifica un microlitro de producto de PCR de la primera etapa con la misma reparación principal y utiliza un perfil de ciclo ligeramente modificado. Ahora separe los productos en un gel AGROS al 2,5% y visualícelos utilizando bromuro AUM o gel verde. Bajo luz ultravioleta, extirpe las bandas de ADN positivas y secuérelas utilizando un kit disponible comercialmente para recolectar el ADN.

Se compararon las características electrofisiológicas de las neuronas en los genes nigra, pars, compacta y pars reticulata. Las neuronas GABAérgicas mostraron una frecuencia más alta, con picos espontáneos alrededor de los 10 hercios. Los picos tenían una duración base de alrededor de un milisegundo tras la inyección de corriente hiperpolarizante.

Las neuronas GABAérgicas mostraron una sutil respuesta SAG que indica una corriente activada semanalmente. Por el contrario, las neuronas dopaminérgicas negras mostraron picos espontáneos de baja frecuencia con una duración de base de alrededor de tres milisegundos. Las neuronas dopaminérgicas también mostraron un SAG pronunciado en respuesta a la hiperpolarización, lo que indica una fuerte expresión de corriente IH en las neuronas GABAérgicas SNR, pero no en las neuronas dopaminérgicas.

La célula R-T-P-C-R detectó ARNm para la descarboxilasa uno del ácido glutámico, una enzima clave en la síntesis de GABA. Por el contrario, se identificaron neuronas dopaminérgicas SNC y SNR, pero no en neuronas GABAérgicas. La R-T-P-C-R de una sola célula detectó ARNm para la tirosina hidroxilasa, una enzima clave para la síntesis de dopamina.

A continuación, se utilizó R-T-P-C-R de una sola celda para perfilar la expresión de subunidades de tres canales KV activadas por voltaje, que varían las propiedades de los canales de potasio dependientes de voltaje. En el ejemplo SNR gaba, los ARNm de las neuronas para KV 3.1, 3.2, 3.3 y 3.4 se detectaron solo en una neurona S-N-R-D-A de ejemplo. Se detectaron KV 3.2, 3.3 y 3.4 en los datos agrupados.

KV 3.1 se detectó con mayor frecuencia en las neuronas SNR GABAérgicas que en las neuronas dopaminérgicas nigro, lo que indica un mayor nivel de expresión de KV 3.1 en las neuronas rápidas VIKING SNR GABA. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y mantener las herramientas libres de ciencia después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la expresión y la función de los receptores y los canales iónicos en el sistema nervioso.