Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

El objetivo general de este procedimiento es detectar ARN mensajeros en neuronas individuales. Esto se logra mediante el registro con micropunción y grabación de neuronas individuales, seguido de la aspiración completa del citoplasma de cada neurona registrada, junto con el ARNm y el citoplasma. Se sintetiza ADNc y se amplifica mediante PCR.

En última instancia, se pueden detectar ARNm específicos para receptores, canales iónicos y enzimas mediante un sistema convencional de imagenología en gel. Mi nombre es, trabajo en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la cantidad de ARNm en un solo neutrón es extremadamente pequeña y se pierde fácilmente.

Comience este protocolo utilizando un vibrátomo para cortar secciones coronales del cerebro de 300 micrómetros de grosor que contengan la parte media rostral de la sustancia negra. Los cerebros pueden aislarse de ratas Sprague Dawley de entre 15 y 40 días de edad. El procedimiento de corte se realiza en hielo, en una solución de corte con alta concentración de sacarosa, oxigenada con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y a un pH de 7,4. Incube las secciones en líquido cefalorraquídeo artificial y burbujee con una mezcla gaseosa de 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno.

Mantenga la temperatura a 34 grados Celsius y deje las secciones allí durante 45 minutos. Luego, mantenga las secciones cerebrales a temperatura ambiente hasta el registro. Comience transfiriendo una sección cerebral a una cámara de registro de parche de voltaje.

Perfusión continua con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado a 32 grados Celsius. Llene las pipetas de registro con solución intracelular autoclave preparada con agua libre de ADN y ARN. Introduzca una pipeta cargada en el baño.

Verifique que la resistencia esté entre dos y tres megaohmios. Primero, localice la sustancia negra por su ubicación anatómica distintiva. Luego, utilizando óptica namar y un objetivo de 60 x, seleccione células grandes en la SNC y la SNR para la grabación.

Estas son posiblemente neuronas dopaminérgicas o GABAérgicas sin duda alguna. Utilice una configuración convencional de celda entera con sello gigaojal para realizar el clampaje de corriente y el clampaje de voltaje. Estas grabaciones generalmente deben realizarse en menos de cinco minutos para minimizar la degradación del ARNm.

En aproximadamente un minuto, es posible obtener huellas electrofisiológicas de las neuronas de interés grabando únicamente sus propiedades de membrana y de generación de potenciales de acción. Después de obtener datos de una neurona de interés, use succión suave con la boca para aspirar el citoplasma. El sello hermético no debe romperse, de lo contrario.

Los desechos extracelulares, incluido el ARNm, pueden ser succionados hacia la pipeta de registro y contaminar el contenido celular. Expulse el contenido celular dentro de un tubo PCR de 0,2 mililitros rompiendo la punta de la pipeta y aplicando una ligera presión positiva. Una vez finalizado, coloque inmediatamente el tubo en un congelador a menos 20 para descartar la contaminación por desechos extracelulares que podrían contener ARNm.

Prepare un control negativo recolectando el contenido de una pipeta de registro introducida en el tejido sin aplicar ninguna aspiración. Inmediatamente después de recolectar el contenido celular de entre 10 y 20 neuronas, comience la reacción de transcripción inversa. Para minimizar la degradación de los ARNm, comience digiriendo cualquier ADN genómico contaminante con ADNasa, durante cinco minutos a 25 grados Celsius.

Este paso es fundamental para reducir los falsos positivos potenciales y no debe omitirse. A continuación, inactivar los ADN añadiendo 1,2 microlitros de EDTA 25 milimolar e incubar las muestras a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Ahora, utilice un kit disponible comercialmente para sintetizar ADNc y verificar que el ADN genómico se haya eliminado completamente.

Realice una reacción control de cada muestra sin transcriptasa inversa. Mientras que todos los demás componentes de la reacción permanecen iguales. Almacene los productos a menos 20 grados Celsius hasta que sean necesarios para el diseño de la PCR.

Primers de acuerdo con las secuencias en GenBank, siempre que sea posible, diseñe reparaciones principales que abarquen T para ayudar a detectar la contaminación con ADN genómico. Para verificar la eficacia de los pares de primers, pruébelos en ADNc de cerebro completo en la primera etapa. Amplifique por PCR cinco microlitros de los 30 microlitros de ADNc durante 35 ciclos utilizando un protocolo estándar de ciclado térmico.

Para la segunda etapa, amplifique por PCR un microlitro del producto de la PCR de la primera etapa con la misma reparación de cebadores y utilice un perfil de ciclado ligeramente modificado. Ahora separe los productos en un gel de AGROS al 2,5 % y visualícelos utilizando bromuro de AUM o gel verde. Bajo luz ultravioleta, excave las bandas de ADN positivas y secuenciélas utilizando un kit disponible comercialmente para recolectar el ADN.

Se compararon las características electrofisiológicas de las neuronas en la sustancia negra, pars compacta y pars reticulata. Las neuronas GABAérgicas de la SNR presentaron una frecuencia más alta de actividad espontánea de disparo de aproximadamente 10 hercios. Los potenciales de acción tuvieron una duración de base de alrededor de un milisegundo tras la inyección de corriente hiperpolarizante.

Las neuronas GABAérgicas de la SNR mostraron una respuesta SAG sutil, lo que indica una corriente débilmente activada. En contraste, las neuronas dopaminérgicas nigrales exhibieron potenciales de acción espontáneos de baja frecuencia con una duración basal de aproximadamente tres milisegundos. Las neuronas dopaminérgicas también mostraron un SAG pronunciado en respuesta a la hiperpolarización, lo que indica una fuerte expresión de la corriente IH en las neuronas GABAérgicas de la SNR, pero no en las neuronas dopaminérgicas.

La R-T-P-C-R de una sola célula detectó ARNm para la descarboxilasa del ácido glutámico uno, una enzima clave en la síntesis de GABA. En contraste, se identificaron neuronas dopaminérgicas del SNC y del SNR, pero no en neuronas GABAérgicas. La R-T-P-C-R de una sola célula detectó ARNm para la tirosina hidroxilasa, una enzima clave en la síntesis de dopamina.

A continuación, se utilizó la R-T-P-C-R de célula individual para analizar la expresión de subunidades del canal KV 3 activado por voltaje, que varían las propiedades de los canales de potasio activados por voltaje. En el ejemplo de neurona SNR gaba, se detectaron ARNm para KV 3.1, 3.2, 3.3 y 3.4 únicamente en una neurona S-N-R-D-A representativa. KV 3.2, 3.3 y 3.4 se detectaron en los datos agrupados.

KV 3.1 se detectó con mayor frecuencia en las neuronas GABAérgicas del SNR que en las neuronas dopaminérgicas nigrales, lo que indica un nivel de expresión más alto de KV 3.1 en las neuronas GABA del SNR de conducción rápida. Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y mantener las herramientas libres de contaminación después de su preparación. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la expresión y la función de los receptores y los canales iónicos en el sistema nervioso.