Name: Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Öğrenin tek hücreli RT-PCR yöntemiyle nigral nöronlarda voltaj-kapılı potasyum kanal mRNA ifadesini analiz etmeyi. Patch clamp ve sitoplazma aspirasyonu ile gen ekspresyonunu inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe R01DA021194 ve R01NS058850 tarafından desteklenmiştir.

1. Beyin dilim hazırlık <ol><li> Genç (15-40 gün eski), erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçan kullanılmıştır. (Biz de bu aynı protokolü fareler kullanın.) Derin üretan anestezisi altında, hayvanlar dekapite ve beyin hızlı bir şekilde disseke edilir. Leica vibratome (VT-1200S) substantia nigra midrostral kısmını içeren sonra 300 mikron kalınlığında koronal beyin dilimleri kesilir. 220 sakaroz, 2.5 KCl 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D-dilim kesme işlemi (mM) içeren bir çözüm kesen bir buz-soğuk, yüksek oksijenli sakaroz yapılır: glikoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 'de korumak için O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile kabarmış. Kesim çözüm prosedürü boyunca buz tutun. </li><li> 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 10: beyin dilimleri içeren oksijenli bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) (mM) ile dolu bir kuluçka odasında inkübe edilir D-glukoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 'de korumak için O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile kabarmış. Inkübasyon sıcaklığı beyin dilim kayıt odasına transfer ° C 45 dakika kadar oda sıcaklığında 34. </li></ol> 2. Nigral nöron Elektrofizyolojik parmak izi <ol><li> Bir beyin dilim 32 oksijenli aCSF ile perfüze sürekli bir yama kelepçe kayıt odasına ° C aktarılır </li><li> Patch pipetler otoklava borosilikat (KG-33) PC-10 çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanılarak cam kapiller tüp (1.10 mm id, 1.65 mm od, Kral Hassas Cam, Claremont, CA) çıkardı ve hücre içi çözeltisi ile doldurulur DNaz-RNaz içermeyen su (Fisher Scientific) (135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl 2, 7.3 pH değeri ayarlanmış içeren) ile hazırlanmıştır. Yama pipetler, banyo M 2-3 dirençleri var. </li><li> Substantia nigra farklı anatomik konumu (Şekil 1A1-2) göre tespit edilir. Nomarski optik ve substantia nigra pars compacta (SNC) ve substantia nigra 60X suya daldırma objektif, geniş hücreler ile donatılmış bir video mikroskobu (Olympus BX51W1) görsel rehberliği altında (SNR) (mümkün DA nöronların ve GABA nöronlar) reticulata seçilen pars kayıt için. Konvansiyonel giga ohm sıkı bir mühür tam hücreli yapılandırma (Şekil 1B1) elde edilir. Şu kelepçe ve gerilim kelepçe analizleri yapılabilir. MRNA bozulması en aza indirmek için, elektrofizyolojik kayıt (≤ 5 dk) kısa olmalıdır. Bir seçenek, çıkarlarını nöron (Şekil B2-3) elektrofizyolojik parmak izi sağlamak için sadece membran ve spiking özellikleri kaydetmek için . Bu kısa kaydı sadece 1 dakika sürer. </li></ol> 3. Sitoplazma aspirasyon <ol><li> SNR GABA ve DA nöronları elektrofizyolojik parmak izi ve karakterizasyonu sonra, nazik ağız emme sitoplazma aspire uygulanır. Hücre çekirdeğinde de genomik DNA kirlenme sonucunda aspire edilebilir. Sıkı mühür kırık olmamalıdır, aksi ekstrasellüler enkaz mRNA da dahil olmak üzere, yama pipet içine emilir ve hücre içeriğini kirletmiş olabilir. -70 MV holding akım arttıkça sürece sıkı mühür bütünlüğünü iyi 100 pA aşmamaktadır. </li><li> Daha sonra aspire hücre içeriğini pipet ucu ve küçük bir pozitif basınç kırarak 0,2 ml PCR tüpü içine atılır. Bir hücrenin içeriğini bir PCR tüpünün içine toplanır. Hücre içeriğini kabul ettikten sonra, PCR tüpü toplayarak, buz üzerinde önceden soğutulmuş hemen -20 ° C derin dondurucuya konur. </li><li> MRNA'ların içerebilir ekstrasellüler enkaz kontaminasyonu ekarte etmek için, yama pipet aslında sitoplazma aspire dokusu içine düşürülür ve sonra RT-PCR pipet içerik tabi tutulur. </li></ol> 4. Ters transkripsiyon (RT) <ol><li> Nöronların, genellikle 10-20 makul bir sayıda hücre içeriğini topladıktan sonra, RT mRNA'ların bozulması en aza indirmek için hemen başlamalıdır. </li><li> Tek bir nöron hücre içeriğini miktarı çok küçük olduğundan, RNA izolasyon prosedürü uygulandı değildir. Potansiyel kirlenmesine neden olan genomik DNA kaldırmak için, aspire hücre içeriğini ilk DNaz I (5 mcL DNaz I ve 1.6 mcL DNaz I Tampon, 5 dakika 25 ° C) tarafından sindirilir. Sonra DNaz 1.2 mcL 25 mM EDTA ekleyerek 5 dakika için 75 ° C'de inkübe inaktive olur. </li><li> cDNA Üst Simge III ters transkriptaz tabanlı Hücreler-Doğrudan cDNA Sentezi kiti (Invitrogen, Tablo 1) kullanılarak sentezlenir. CDNA İlk iplikçik, 50 sentezlenmiş ° C de 50 dakika sonra reaksiyon 85 ° C 5 dakika ve 1 mcL RNaz H ekleyin kuluçka tarafından inaktive olured mRNA (37 ° C 20 dk) sindirmek için. Tek telli cDNA daha sonra PCR için -20 ° C'de saklanır. </li><li> Genomik DNA tamamen çıkarılması, diğer tüm reaksiyon bileşenlerini tam olarak aynı iken ters transkriptaz ihmal edildiği RT-eksi kontrolü ile doğrulanır. </li></ol> 5. İki aşamalı PCR <ol><li> Astarlar GenBank dizileri, göre dizayn edilmiştir. Mümkün olduğunca, intron kapsayan primer çiftleri yardım genomik DNA kirlenme tespit kullanılmıştır. Primer çiftinin dizilimini Tablo 2'de listelenmiştir. Primer çiftlerinin etkinliğini ilk pozitif ürün veren tüm beyin mRNA'ların tarafından kontrol edilmelidir. Bütün primerler Entegre DNA Teknolojileri (Coralville, Iowa, ABD) tarafından sentezlenen. </li><li> İlk aşamada, 30 mcL cDNAs 5 mcL varlığında primer çifti (Tablo 2) 35 döngü için yükseltilir. Termal cycler termal bisiklet protokolü (Mastercycler, Eppendorf, Tablo 1), 2 dakika 94 ° C, ilk denatürasyon 94 15 sn sonra 35 döngü ° C doğasını, 30 s: 55 ° C tavlama için 45 s ve 72 ° C, son uzatma için 7 dakika takip uzatmak için. PCR süper mix (Invitrogen, Tablo 1) Taq DNA polimeraz, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP) ve PCR için gerekli tüm diğer bileşenler tarafından sağlanan </li><li> Ikinci aşamada PCR, 1. Aşama PCR 1 mcL ürün şablon olarak kullanılır ve ilk aşamada kullanılan aynı primer çifti kullanılmıştır (Tablo 2). 30 kısaltılmış uzatma süresi ile 40 döngü çalıştırılır s Aynı PCR süper karışımı kullanılır. </li><li> 2. aşama amplifikasyon PCR ürünleri% 2.5 agaroz jel elektroforezi ile ayrılmış, UV ışığı altında etidyum bromür (0.05 mg/100 ml jel) veya gelgreen tarafından görüntülendi ve fotoğraflandı (B4 Şekil). Pozitif bantlar sonra kesip, bir Qiagen ekstraksiyon kiti (Tablo 1) ve sıralı kullanarak ayıklanır ve hedef genlerin yayınlanan dizileri ile karşılaştırıldı. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Substantia nigra pars compacta ve reticulata pars ve substantia nigra komşu GABA projeksiyon nöronlar dopamin (DA) nöronlar pars reticulata farklı elektrofizyolojik karakteristikleri (Ding ve ark 2011. Zhou ve ark 2006). Şekil. 1B2, SNR GABA nöronlar 10 Hz etrafında yüksek frekanslı spontan spike sergilerler. Ani, etrafında bir baz süresi 1 ms var. Mevcut enjeksiyon hiperpolarizan üzerine, bu nöronların akımı I h (Şekil 1B2) zayıf bir ifade gösteren SNR GABA nöronlar, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan yanıt zayıf bir depolarizan sarkma gösterir. Buna karşılık, nigral DA nöronları (2 Hz etrafında) 3 ms etrafında bir baz süresi kendiliğinden ani düşük frekanslı sergilerler. DA nöronlar saat akımı (Şekil 1B3) (Ding ve ark 2011, Zhou ve ark 2006) güçlü bir ifade de, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki gösteren belirgin bir sarkma gösterir . scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöronlar glutamik asit dekarboksilaz 1 (GAD1 GABA nöronların GABA sentezi ve bir işaretleyici için anahtar enzim) mRNA algılandı, ancak DA nöronları (Şekil 1B4, 5). Aksine, scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNC ve SNR DA nöronları tirozin hidroksilaz (TH, DA nöronlar dopamin sentezi ve bir işaretleyici anahtar enzim) için mRNA tespit ancak GABA nöronlar (Şekil 1B4, 5). Yani scRT-PCR sonuçları elektrofizyolojik nöron kimlik onaylayın. Sonra, scRT-PCR voltaj aktive Kv3 kanal alt birimden, Kv3.1, Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 ifade profil kullanılmıştır. Bu alt birimden voltaj kapılı K oluşturmak için katkıda + altbirim kompozisyon (Ding ve ark 2011) bağlı olarak farklı özellikleri kanallar. SNR GABA nöron örnekte Şekil. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 1B4, mRNA'ların tespit edildi. Örnekte SNR DA nöron, Fig.1B5 gösterilen sadece Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 tespit edildi. Bizim toplanmış veriler, Kv3.1 daha sık, hızlı spike SNR GABA nöronlar (Ding ve ark 2011) Kv3.1 daha yüksek bir ifadesi seviyesi gösteren SNR GABA nöronlar nigral DA nöronları daha tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. SNR GABA nöronlar ve nigral DA nöronları Elektrofizyolojik kimlik: nigral alanlarda farklı anatomik konumunu tespit edilebilir. A1 1X amacı ile çekilen koronal Nissl lekeli bir bölümünde, SNC ve SNR yerini gösterir . Kutulu alan captur10X objektif ve orta görüntülenen ed ok ile gösterilen. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR açıkça göze çarpıyor. A2 4X bir hedefi ile yakalanan canlı, lekesiz koronal bölümünde SNC ve SNR yerini gösterir. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR de açıkça tanımlanabilir. Tüm hücre modunda kenetli bir SNR GABA nöron yama gösterir. VTA, ventral tegmental alan. B1, B2 mevcut kelepçe kayıt modunda SNR GABA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Bu nöronlar yangın kendiliğinden yüksek frekanslı eylem, kısa bir süre potansiyel ve mevcut enjeksiyon hiperpolarizan zayıf bir I h-aracılı sarkma tepki var. B3 geçerli kelepçe kayıt modunda nigral DA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Onlar, uzun süren spontan düşük frekanslı aksiyon potansiyelleri ateş ve belirgin bir h-aracılı sarkma (ok başı) mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki var . Böylece, SNR GABA nöronlar ve nigral dopamin nöronları açıkça. Elektrofizyolojik tespit B4 bir elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöron scRT-PCR ürünleri bir jel resmi gösterir. Glutamat dekarboksilaz 1 (GAD1) ​​mRNA ancak Tirozin hidroksilaz (TH) mRNA tespit edildi. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA'ların bu SNR GABA nöron tespit edildi. B5 SNR DA nöron nöron Kv3 kanal mRNA'ların scRT-PCR gösterir. TH mRNA ancak GAD1 mRNA elektrofizyolojik tespit SNR DA nöron tespit edildi. Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA'ların bu SNR DA nöron B6 toplanmış verileri gösterir tespit edildi. 7. Olası yanlış negatif ve yanlış pozitif sonuçlar Edindiğimiz deneyimlere dayanarak, çeşitli faktörler, yanlış negatif scRT-PCR sonuçlarına yol açabilir. Bu faktörler, yeterli miktarda sitoplazma pipet tıkanma, RNaz kirlenme ve verimsiz PCR primerleri yama nedeniyle aspire yetersizlik sayılabilir. Patch pipet tıkanma genellikle video monitörde görülür ve daha fazla erişim direnci ile gösterilir. RNaz kirlenme doğru hareket ettirilir ve eldiven ile önlenebilir. Bir beyin doku yumruk toplam RNA PCR primer etkinliği test edilmelidir (Zhou ve ark 2008;. Ding ve ark 2011). RT öncesinde ilk örnekleri tedavi etmek için her zaman DNaz kullanmak zamandan beri, biz yalancı pozitif sonuç ile karşılaşmadım. Teorik olarak, DNaz sindirim olmadan, genomik DNA kontaminasyonu ve böylece gen intronsuz veya primer çifti yanlış pozitif algılama ortaya çıkabilir intron bölgesi yayılabilir değildir.

<ol><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li>
<li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li>
<li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li>
<li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li>
<li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li>
<li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

ScRT-PCR ile beyin dilim yama kelepçe kayıt kombinasyonu burada iyon kanalları, reseptörleri ve ayrı ayrı karakterize nöronlar nörotransmitter sentezi için önemli enzimler için mRNA ekspresyon profilleri araştırmak için mükemmel bir yöntem sağlamak gösterdi. (Zhou ve ark 2009. Surmeier ve ark 1996), söz konusu proteinin tespit edilir ve düşük ekspresyon seviyesi ve / veya uygun antikor eksikliği nedeniyle immünohistokimya gibi diğer yöntemleri kullanarak lokalize edilemez zaman yararlıdır. ScRT-PCR, yüksek hassasiyet ve...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tablo 1"> Tablo 1: Anahtar reaktifler ve ekipman <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tablo 2"> Tablo 2. Primer çiftleri sıçan Kv3 kanal nöronal, tirozin hidroksilaz (TH) ve glutamik asit dekarboksilaz 1 (GAD1) ​​scRT-PCR için mRNA'ların

voltaj-kapılı potasyum kanal mrna gösterilmeden tek hücreli rt-pcr teknikleri kullanarak nigral nöronlar

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Memeli santral sinir sistemi, nöronların farklı moleküler ve fonksiyonel özellikleri ile farklı türleri birbirlerine ayırmak için zor ve aynı zamanda kolaylıkla morfolojisi tarafından belirlenen iç içe. Böylece, belirli bir nöron türü gen ekspresyonu analiz etmek genellikle zordur. Burada önemli nigra nöronlarının farklı tipte profil mRNA tek hücreli ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (scRT PCR) ile tam hücreli yama kelepçe kayıt teknikleri birleştiren bir prosedür belge. Elektrofizyolojik teknikleri ilk bireysel nöronların nörofizyolojik ve fonksiyonel özellikleri kaydetmek için kullanılır. Sonra, elektrofizyolojik karakterize tek nigral nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, reseptörler ve iyon kanalları için mRNA profillerini elde etmek için scRT-PCR analizine tabi tutulur. Yüksek seçicilik ve duyarlılık immünohistokimya, uygun antikor ya da protein ekspresyon seviyesi düşük eksikliği nedeniyle kullanılamaz zaman bu yöntem özellikle yararlı olun. Bu yöntem aynı zamanda diğer beyin bölgeleri nöronların için geçerli.

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA&#39;ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Memeli merkezi sinir sisteminde, farklı moleküler ve fonksiyonel özelliklere sahip çeşitli nöron tipleri birbirleriyle iç içe geçmiş durumdadır, ...

Bu prosedürün genel amacı, tekil nöronlardaki haberci RNA'ları saptamaktır. Bu işlem, patch clamp yöntemiyle tekil nöronların kaydedilmesi, ardından kaydedilen her nöronun sitoplazmasının tamamen aspire edilmesi, mRNA ve sitoplazmadan cDNA sentezlenmesi ve PCR ile amplifiye edilmesi yoluyla gerçekleştirilir.Nihayetinde, reseptörler, iyon kanalları ve enzimler için spesifik mRNA'lar, geleneksel bir jel görüntüleme sistemi aracılığıyla tespit edilebilir. Benim adım [isim], University of Tennessee Health Science Center'da çalışıyorum. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tek bir nöronla elde edilen mRNA miktarı son derece düşük olduğu ve kolayca kaybolabildiği için zorluk yaşarlar.Bu protokole, substantia nigra'nın orta rostral kısmını içeren 300 mikrometre kalınlığında koronal beyin kesitleri almak için bir vibratom kullanarak başlayın. Beyinler, 15 ila 40 günlük Sprague Dawley sıçanlarından izole edilebilir. Kesit alma işlemi; %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile oksijene edilmiş, pH değeri 7.4 olan yüksek sükroz içerikli bir kesme solüsyonu içinde buz gibi soğuk ortamda gerçekleştirilir; kesitleri, %5 karbondioksit ve %95 oksijen gazı ile havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı içerisinde inkübe edin.Sıcaklığı 34 °C'de sabitleyin ve dilimleri orada 45 dakika bekletin. Ardından, kayıt aşamasına kadar beyin dilimlerini oda sıcaklığında tutun. Bir beyin dilimini patch clamp kayıt haznesine aktararak işleme başlayın.32 °C'de oksijenlendirilmiş yapay beyin omurilik sıvısı ile sürekli olarak perfüze edilir. Yama pipetlerini, DNA ve RNA içermeyen su ile hazırlanmış ve otoklavlanmış hücre içi solüsyonla doldurun. Dolu pipeti banyoya indirin.Direncin iki ile üç mega ohm arasında olduğunu kontrol edin. İlk olarak, substantia nigra'yı belirgin ve anatomik konumundan tespit edin. Ardından, namar optikleri ve 60 x objektif kullanarak, kayıt için SNC ve SNR'deki büyük hücreleri seçin.Bunlar tereddütsüz bir şekilde olası dopaminerjik veya GABAerjik nöronlardır. Akım kenetleme ve voltaj kenetleme yapmak için geleneksel bir giga sızdırmaz mühürlü tüm hücre konfigürasyonu kullanın. mRNA degradasyonunu minimize etmek için bu kayıtlar genellikle beş dakikadan kısa sürede gerçekleştirilmelidir.Sadece membran ve spike özelliklerini kaydederek, yaklaşık bir dakika içinde ilgili nöronlar için elektrofizyolojik parmak izleri sağlamak mümkündür. İlgili bir nörondan veriler elde ettikten sonra, sitoplazmayı aspire etmek için nazikçe ağızla vakumlama yapın. Sıkı sızdırmazlık bozulmamalıdır, aksi takdirde.mRNA dahil olmak üzere hücre dışı kalıntılar, yama pipetine çekilebilir ve hücre içeriğini kontamine edebilir. Pipet ucunu kırıp hafif pozitif basınç uygulayarak hücre içeriğini 0.2 milliliter PCR tüpüne aktarın. İşlem tamamlandığında, mRNA içerebilecek hücre dışı kalıntıların kontaminasyon riskini ortadan kaldırmak için tüpü derhal -20 °C dondurucuya yerleştirin.Herhangi bir aspirasyon uygulamadan, dokuya indirilmiş bir patch pipeti içeriğini toplayarak negatif kontrol oluşturun. 10 ila 20 nöron arasından hücre içeriğini topladıktan hemen sonra ters transkripsiyon reaksiyonuna başlayın. mRNA'ların degradasyonunu minimize etmek için, önce kontaminan genomik DNA'yı DNase ile 25 °C'de beş dakika boyunca sindirerek başlayın.Bu adım, potansiyel yanlış pozitifleri azaltmak açısından kritiktir ve atlanmamalıdır. Ardından, DNA'ları 1,2 µL 25 mM EDTA ile inaktive edin ve örnekleri 70 °C'de beş dakika inkübe edin. Şimdi, genomik DNA'nın tamamen uzaklaştırıldığını doğrulamak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak cDNA sentezleyin.Her örnek için ters transkriptaz içermeyen bir kontrol reaksiyonu yürütün. Bu sırada diğer tüm reaksiyon bileşenleri aynı kalmalıdır. Ürünleri, PCR tasarımı için gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.Mümkün olduğunca Gen bank'taki dizilere göre primerler hazırlayın ve genomik DNA kontaminasyonunu tespit etmeye yardımcı olması için intronu kapsayan primerler tasarlayın. Primer çiftlerinin etkinliğini kontrol etmek için, ilk aşamada bunları tüm beyin cDNA'sı üzerinde test edin. Standart bir termal döngü protokolü kullanarak, 30 µL'lik cDNA'ların 5 µL'sini 35 döngü boyunca PCR ile amplifiye edin.İkinci aşama için, ilk aşama PCR ürününün bir mikrolitresini aynı primer çiftiyle PCR ile çoğaltın ve hafifçe modifiye edilmiş bir döngü profili kullanın. Ardından ürünleri %2,5 AGROS jel üzerinde ayırın ve EtBr veya gel green kullanarak görselleştirin. UV ışığı altında, pozitif DNA bantlarını kesin ve DNA'yı toplamak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak bunları sekanslayın.Substantia nigra'nın pars compacta ve pars reticulata bölgelerindeki nöronların elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırılmıştır. SNR GABAerjik nöronlar, yaklaşık 10 hertz civarında daha yüksek frekanslı spontan spike'lar sergilemiştir. Spike'lar, hiperpolarize edici akım enjeksiyonu üzerine yaklaşık bir milisaniyelik bir taban süresine sahipti.SNR GABAerjik nöronlar, zayıf bir aktive akımına işaret eden hafif bir SAG yanıtı göstermiştir. Buna karşılık, nigro dopaminerjik nöronlar, taban süresi yaklaşık üç milisaniye olan düşük frekanslı spontan spike'lar sergilemiştir. Dopaminerjik nöronlar ayrıca hiperpolarizasyona yanıt olarak belirgin bir SAG göstermiştir; bu durum, IH akımının SNR GABAerjik nöronlarda güçlü bir şekilde eksprese edildiğini, ancak dopaminerjik nöronlarda edilmediğini göstermektedir.Tek hücreli R-T-P-C-R, GABA sentezinde anahtar bir enzim olan glutamik asit dekarboksilaz bir için mRNA tespit etti. Buna karşılık, tek hücreli R-T-P-C-R, dopamin sentezi için anahtar bir enzim olan tirozin hidroksilaz için mRNA'yı tanımlanmış SNC ve SNR dopaminerjik nöronlarda tespit etti, ancak GABAerjik nöronlarda tespit etmedi.Ardından, voltaj kapılı potasyum kanallarının özelliklerini değiştiren voltajla aktive olan KV3 kanal alt birimlerinin ekspresyon profilini çıkarmak için tek hücre R-T-P-C-R kullanıldı. SNR gaba örneğinde, KV 3.1, 3.2, 3.3 ve 3.4 için nöron mRNA'ları yalnızca örnek bir S-N-R-D-A nöronunda tespit edildi. KV 3.2, 3.3 ve 3.4 ise havuzlanmış verilerde tespit edildi.KV 3.1, SNR GABAerjik nöronlarda nigro dopaminerjik nöronlara göre daha sık tespit edilmiştir; bu durum, hızlı ateşleme yapan SNR GABA nöronlarında KV 3.1'in daha yüksek bir ekspresyon seviyesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, eldiven giymeyi ve araçlar geliştirildikten sonra bunları kontaminasyondan uzak tutmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların sinir sistemindeki reseptörlerin ve iyon kanallarının ekspresyonunu ve fonksiyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.

Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

Bu çalışma, gözenekli membran insertleri kullanarak aksonal mRNA'ları izole etmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır; böylece toplam nöron ve nörit ayrımı ve RNA arındırmasını mümkün kılar. RTddPCR ile birleştiğinde, bu yaklaşım düşük kopyalı transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar; mRNA taşınımı ve yerel çeviri çalışmalarını yüksek duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve geniş deneysel uygulama ile kolaylaştırır.

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Öğrenin tek hücreli RT-PCR yöntemiyle nigral nöronlarda voltaj-kapılı potasyum kanal mRNA ifadesini analiz etmeyi. Patch clamp ve sitoplazma aspirasyonu ile gen ekspresyonunu inceleyin.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Daha fazla video keşfet