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Neurociencia
0 vistas • 2:58 min • July 8th, 2025
Tome un tracto gastrointestinal de ratón embrionario fijo y transgénico en la etapa de desarrollo deseada.
El sistema nervioso entérico del tracto gastrointestinal incluye neuronas entéricas y neuronas colinérgicas que expresan colina acetiltransferasa.
Estas neuronas colinérgicas también expresan una proteína fluorescente impulsada por el promotor de la colina acetiltransferasa.
Incube el tracto con un detergente no iónico y proteínas para permeabilizar las células y evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Reemplácelo con anticuerpos primarios. Incubar para que los anticuerpos se unan a sus proteínas diana en las neuronas, respectivamente.
Retire los anticuerpos no unidos y lave con tampón.
Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para unirse específicamente a los anticuerpos primarios unidos a las proteínas diana.
Retire el exceso de anticuerpos y lave con tampón.
Sumerja el tracto marcado en un medio de montaje que contenga un tinte nuclear para teñir los núcleos. Ahora, monte un cubreobjetos.
Usando microscopía confocal, visualice y analice la distribución de las neuronas colinérgicas en el tracto gastrointestinal.
Coloque los tractos gastrointestinales en un tubo de 0,2 mililitros que contenga una solución bloqueante, que consiste en 1x PBS, albúmina de suero bovino al 3%, 0,1 Triton X-100 y roce durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, aspire la solución de bloqueo con una pipeta Pasteur de punta fina y reemplácela con la dilución óptima de anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo.
Incube durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados en la plataforma oscilante. Después de la incubación primaria de anticuerpos, aspire la solución de anticuerpos y enjuague los tractos gastrointestinales en PBS tres veces durante cinco minutos cada una, y luego durante una hora a temperatura ambiente con balanceo.
Después del último lavado, reemplace el PBS con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos diluidos en una solución bloqueante y coloque los tubos en la plataforma oscilante en la oscuridad durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados.
Después de lavar los tractos gastrointestinales como antes, coloque unas gotas de medios de montaje de fluorescencia con DAPI en un portaobjetos de vidrio, luego, sumerja el tracto gastrointestinal en el medio de montaje y agregue un cubreobjetos. Finalmente, capture imágenes de cada fluoróforo con un microscopio confocal, luego realice un análisis de imágenes asistido por computadora con el software adecuado.