Una inyección de vector viral en la rata Substantia nigra para el modelado de enfermedades neurodegenerativas

Asegure una rata anestesiada en un marco estereotáctico.

Desinfecte el cuero cabelludo y haga una incisión en la línea media craneal para exponer el cráneo.

Identifique el bregma y la lambda, dos puntos de referencia en el cráneo, para determinar el lugar de la inyección.

Prepare una jeringa de microinyección que contenga una suspensión de vector viral.

El vector viral lleva un transgén que codifica alfa-sinucleína, una proteína que sufre un plegamiento incorrecto y agregación en las neuronas de la sustancia negra en enfermedades neurodegenerativas.

Coloque la jeringa en el instrumento estereotáxico conectado a una bomba de microinyección.

Cree un orificio de rebaba en el lugar de la inyección, evitando lesiones cerebrales.

Penetre la duramadre con una aguja y limpie la sangre con tejido estéril.

Inserte la aguja de microinyección a través del orificio de la rebaba para llegar a la sustancia negra.

Inyecte lentamente la suspensión viral, asegurando una distribución uniforme.

Haga una breve pausa para evitar el reflujo, luego retire lentamente la aguja.

Sutura la incisión.

El modelo ahora está listo para un análisis más detallado.

Comience anestesiando adecuadamente a una rata Wistar hembra de ocho semanas de acuerdo con los protocolos aprobados. Verifique que se haya logrado un plan quirúrgico de anestesia apretando cada pata y notando la ausencia del reflejo de abstinencia. A continuación, use un implantador de microtranspondedor para colocar un microtranspondedor en la espalda de la rata. Compruebe que el microtranspondedor esté colocado correctamente y que se pueda obtener una lectura.

Ahora corte el pelo del cuero cabelludo de la rata y aplique anestesia local en el cuero cabelludo y las orejas. Transfiera la rata a una campana de flujo laminar y realice el resto del procedimiento mediante una técnica aséptica. Coloque la rata en el marco estereotáxico asegurando las barras de los oídos, seguido de la barra de la boca y la nariz. Cubre el cuerpo de la rata con una manta de papel para evitar que baje la temperatura corporal. Aplique un lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen.

A continuación, desinfecte el cuero cabelludo de acuerdo con los procedimientos aprobados. Aquí se usa yodo al 1% en isopropanol al 70%. Después de hacer una pequeña incisión en la línea media del cuero cabelludo, raspe suavemente las membranas del cráneo y enjuague con solución salina. Después de permitir que el cráneo se seque, asegúrese de que el bregma y la lambda se puedan ver claramente.

Ahora, llene una jeringa de microinyección de 10 microlitros, calibre 30 y 20 milímetros con AAV recombinante y colóquela en la bomba de microinyección motorizada conectada al instrumento estereotáxico.

Para la transducción específica de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, los vectores AAV recombinantes son la primera opción debido a sus altos títulos y eficiencia para transducir neuronas dopaminérgicas.

Pruebe el flujo liberando una gota de AAV. Deseche cualquier AAV liberado en un detergente de limpieza polivalente. Compruebe visualmente que el cabezal esté fijo en el marco del cabezal. Luego verifique que el cráneo esté plano moviendo primero la punta de la aguja hacia bregma y midiendo la altura en este punto bajando la punta de la aguja en la dirección dorsoventral, hasta que toque el cráneo. Repita el procedimiento en lambda.

Después de devolver la aguja al bregma, mueva la aguja en dirección anteroposterior y mediolateral a las coordenadas estereotáxicas para la microinyección. Escribe las coordenadas. En el lugar de la inyección, mida la altura del cráneo como antes y asegúrese de que no difiera más de 0,3 milímetros de la altura del bregma.

Luego taladre con cuidado un agujero de 2 milímetros en el cráneo. Una vez perforado el agujero, mida la altura de la duramadre para determinar la referencia desde la cual aplicar la coordenada dorsoventral. Penetre la duramadre con una aguja de calibre 26. Absorba la sangre con un tejido estéril y proceda solo después de que se haya detenido todo el sangrado.

Ahora baje lentamente la aguja de la jeringa de microinyección precargada en el cerebro hasta la coordenada ventral dorsal y haga una pausa por un minuto. Luego inyecte tres microlitros de AAV a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto. Después de la inyección, deje que la aguja permanezca en su lugar durante otros cinco minutos para evitar el reflujo a lo largo de la pista de la aguja antes de retirarla lentamente.

Coser el cuero cabelludo con poliéster trenzado recubierto 3.0 y desinfectar la piel con yodo al 1% en isopropanol al 70%, para aflojar la barra de la nariz y la boca, y luego las dos barras de los oídos para retirar suavemente al animal del instrumento estereotáctico. En este momento, administre analgesia y, si es necesario, un agente de reversión de la anestesia. Luego, coloque a la rata en una jaula limpia sobre una placa calefactora a 38 grados centígrados y vigile de cerca hasta que se despierte.