Aislamiento de agregados de proteínas insolubles en detergente a partir de tejido cerebral humano post mortem

Comience con una muestra de tejido cerebral humano postmortem congelada de un caso confirmado de enfermedad neurodegenerativa.

Eliminar la materia gris rica en agregados proteicos insolubles, un sello distintivo de la enfermedad.

Transfiera el tejido a un homogeneizador.

Agregue un tampón que contenga inhibidores y homogeneice para liberar componentes intracelulares.

Los inhibidores bloquean las enzimas proteasa y fosfatasa, evitando la degradación de proteínas.

Transfiera el homogeneizado a un tubo y agregue un tampón de detergente iónico. Incubar.

El detergente solubiliza las proteínas plegadas de forma nativa, mientras que los agregados de proteínas mal plegados permanecen intactos.

Sonicar para completar la disociación celular.

Transfiera el homogeneizado a un tubo de ultracentrífuga y centrifugue a alta velocidad.

Los agregados se asientan en la parte inferior.

Retire el sobrenadante que contiene proteínas solubles en detergente.

Lave los agregados con un tampón de detergente iónico, centrifugue y elimine el sobrenadante.

Agregue tampón de urea para desnaturalizar los agregados de proteínas, haciéndolos solubles.

Transfiera los agregados de proteínas solubilizados a un tubo y sonique brevemente para asegurar una disolución completa.

Obtenga tejido cerebral postmortem congelado de un control sano y una EA confirmada patológicamente. Use fórceps y una cuchilla de afeitar para extirpar porciones de aproximadamente 250 miligramos de materia gris de cada muestra de tejido. Deje que el segmento cerebral se descongele durante un minuto. Ahora, corta un trozo de tejido en trozos cúbicos de aproximadamente dos milímetros a medida que se descongela. Transfiera a un tubo homogeneizador de gotas preenfriado de dos mililitros con hielo.

Recuerde evitar la materia blanca y los vasos sanguíneos grandes.

Trabaje rápidamente y coloque el pañuelo en botes de pesaje desechables de lágrimas. Tenga cuidado de evitar que el tejido se descongele colocando con frecuencia el bote de pesaje con tejido cerebral en recipientes de poliestireno con hielo seco. Después de diseccionar y pesar todos los trozos de tejido necesarios, retire un bote de pesaje que contenga un trozo de tejido del hielo seco.

A continuación, agregue cinco mililitros de tampón bajo en sal helado con cóctel de inhibidor de proteasa y fosfatasa por gramo de tejido, y homogeneice en hielo usando aproximadamente 10 golpes de mortero A de alto despeje y 15 golpes de mortero B de bajo despeje. Luego, use una pipeta Pasteur de vidrio de nueve pulgadas para transferir cada homogeneizado a un tubo de polipropileno de dos mililitros etiquetado. Alícuota el homogeneizado restante en tubos adicionales etiquetados de 1,5 mililitros de manera similar para su almacenamiento a -80 grados Celsius.

Para proceder con el fraccionamiento, agregue 100 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y 100 microlitros de Sarkosyl al 10% a cada alícuota de 0,8 milímetros. Mezclar bien por inversión, y luego incubar en hielo durante 15 minutos. Después de la incubación, utilice un sonicador equipado con una sonda de micropunta para administrar tres pulsos de 5 segundos al 30% de amplitud.

Después de usar el método del ácido bicinconínico para determinar las concentraciones de proteínas de los homogeneizados, agregue tampón sark helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa a cada muestra hasta una concentración final de 10 miligramos por milímetro. Luego, transfiera 500 microlitros de cada muestra a tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 microlitros.

Cargue los tubos en un rotor preenfriado y ultracentrífuzca a 180.000 veces g durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes solubles de sarkosyl S1 a tubos de 1,5 mililitros y guárdelos a -80 grados Celsius. Agregue 200 microlitros de tampón sark a los tubos de ultracentrífuga que contienen las fracciones P1 insolubles en detergente y use la punta de la pipeta para desalojar los gránulos del fondo de los tubos de ultracentrífuga.

A continuación, transfiera los gránulos P1 resuspendidos a nuevos tubos de ultracentrífuga de 500 microlitros, equilibre el par y centrifugue a 180.000 veces g durante 30 minutos adicionales a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante S2, luego agregue de 50 a 75 microlitros de tampón de urea con cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa a los gránulos insolubles en sarkosil e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para solubilizar el gránulo P2.

Después de la incubación, transfiera los gránulos de P2 resuspendidos a tubos marcados de 0,5 milímetros y solubilice completamente los gránulos mediante una breve sonicación de micropuntas de 1 segundo al 20% de amplitud. Determinar las concentraciones de proteínas de las fracciones solubles en sarkosil e insolubles en sarkosil utilizando el método de ensayo BCA.