Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 1:58 min. • July 8th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga una barrera hematoencefálica in vitro o un modelo BBB.
Este modelo consiste en células endoteliales adheridas al lado superior o sanguíneo y astrocitos en el lado inferior o cerebral de un inserto de membrana recubierto de matriz.
Agregue isotiocianato de fluoresceína o FITC, un tinte fluorescente, a la cámara superior de un pocillo de control.
Por el contrario, agregue ferritina cargada con FITC, o FITC-ferritina, a la cámara superior de un pocillo de muestra y luego incube.
En el pozo de control, el FITC libre permanece confinado a la cámara superior, con un cruce mínimo a través de la BBB.
Mientras tanto, en el pocillo de la muestra, los complejos FITC-ferritina se unen a los receptores de las células endoteliales.
Esto permite la internalización mediada por receptores y el transporte a la cámara inferior.
A continuación, recolecte regularmente el medio de las cámaras inferiores de ambos pocillos y mida la intensidad de la fluorescencia.
El control exhibe una fluorescencia más baja, mientras que la muestra muestra una fluorescencia más alta, lo que confirma la permeabilidad diferencial de la BBB para FITC y FITC-ferritina.
Para medir el flujo de ferritina de FITC a través del sistema de barrera hematoencefálica, agregue ferritina cargada con FITC o FITC libre a la parte superior de al menos tres sistemas de barrera hematoencefálica para cada formulación.
Después de siete horas en una incubadora, extraiga 2 mililitros de medio de las cámaras inferiores de tres insertos de muestra y control. Mida la intensidad de fluorescencia de 500 microlitros de las muestras recolectadas con un espectrofluorómetro y determine la concentración de FITC permeado o FITC-ferritina de acuerdo con las instrucciones en la parte escrita del protocolo.