Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Tome cultivos de microislas de neuronas de dopamina de ratón embrionarias primarias en una placa de múltiples pocillos que contiene medios.

Estas neuronas se tratan previamente con fibrillas preformadas (PFF), formas mal plegadas y agregadas de la proteína alfa-sinucleína.

Los PFF actúan como semillas, desencadenando un mayor plegamiento y oligomerización de la alfa-sinucleína endógena, formando fibrillas de alfa-sinucleína fosforiladas. Estas fibrillas eventualmente forman cuerpos de Lewy.

Reemplace el medio con un fijador para preservar la morfología celular.

Lave las células con tampón.

Introduzca un tampón que contenga detergente para permeabilizar las membranas celulares.

Agregue una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a la alfa-sinucleína fosforilada y una proteína de referencia que se expresa de forma ubicua en las neuronas de dopamina.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Introducir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los respectivos anticuerpos primarios.

Lavar nuevamente para eliminar los anticuerpos no unidos.

Agregue un tinte de unión al ADN para teñir los nú