Obtención de suspensiones celulares a partir de tejidos cerebrales de ratón isquémico
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:47 min • July 8th, 2025
Tome tejidos cerebrales isquémicos de ratón perfundidos que contengan células cerebrales y células inmunitarias infiltradas.
Pica los pañuelos en un colador y enjuaga con tampón.
Centrifugar el filtrado y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo en una solución de enzimas digestivas y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.
Incubar para que las enzimas digestivas descompongan la matriz extracelular, aflojando las células.
Filtre la suspensión y enjuague con un tampón que contenga ADNasa para eliminar el ADN contaminante.
A continuación, lave con tampón sin DNasa.
Centrifugar el filtrado y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender las celdas en el medio de gradiente de densidad. Luego, transfiera el contenido a un tubo nuevo y mezcle. Centrífuga para separar los componentes por densidad.
Retire el sobrenadante que contiene mielina y desechos.
Vuelva a suspender el gránulo en tampón libre de ADNasa. Transfiéralo a un tubo nuevo y centrifugue nuevamente.
Deseche el sobrenadante para asegurar una eliminación suficiente del medio de gradiente de densidad.
Finalmente, vuelva a suspender las celdas en el búfer para un análisis más detallado.
Usando el extremo del émbolo de una jeringa de 5 mililitros, triture los trozos de tejido cerebral a través de un colador de células de 100 micrones, enjuagando continuamente el colador con HBSS helado con calcio y magnesio. Luego coloque los tejidos homogeneizados en hielo.
Cuando se hayan procesado todas las muestras, reduzca las suspensiones celulares. Y deseche con cuidado los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en 1 mililitro de tampón de digestión. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo de 2 mililitros.
E incubar las células bajo rotación lenta y continua a 37 grados centígrados. Después de una hora, tamizar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras. Y enjuague bien el filtro con 3 mililitros de tampón de lavado que contenga DNasa. Luego lave el colador con 15 mililitros de tampón de lavado sin DNasa. Gire las celdas hacia abajo y deseche el sobrenadante.
Para eliminar los restos celulares y la mielina, vuelva a suspender las células en 5 mililitros de medio de gradiente de densidad al 25% a temperatura ambiente y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Mezcle bien las células y el gradiente con un pipeteo suave repetido. Luego gire la solución celular.
Al final de la separación, aspire con cuidado la capa de mielina y el sobrenadante sin alterar el gránulo. Y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de tampón de lavado sin DNasa. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y gírelas hacia abajo nuevamente, resuspendiendo el gránulo en 100 microlitros de tampón de lavado en frío.
Resumen
Este artículo describe un protocolo detallado para aislar células cerebrales a partir de tejidos cerebrales isquémicos de ratón perfundidos. El método comprende varios pasos, incluyendo la picadura del tejido, la digestión enzimática y la centrifugación en gradiente de densidad para obtener una suspensión celular pura destinada a análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Inmunología
Antecedentes
- Comprender la composición celular de los tejidos cerebrales isquémicos es fundamental para estudiar la neuroinflamación.
- El aislamiento de tipos celulares específicos puede ayudar a investigar sus funciones en la lesión cerebral y la reparación.
- Los protocolos estandarizados son esenciales para la reproducibilidad en la investigación.
- Este método permite la extracción de células viables para aplicaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para aislar células cerebrales de tejidos isquémicos.
- Facilitar el estudio de la infiltración de células inmunitarias en el cerebro.
- Mejorar la comprensión de las respuestas celulares en condiciones isquémicas.
Métodos Utilizados
- Perfusión de tejidos cerebrales de ratón para eliminar células sanguíneas.
- Fragmentación y digestión enzimática de los tejidos para liberar células.
- Filtración y centrifugación para purificar suspensiones celulares.
- Centrifugación en gradiente de densidad para separar diferentes tipos celulares.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células cerebrales viables a partir de tejidos isquémicos.
- Eliminación eficaz de mielina y restos durante el proceso de purificación.
- Alto rendimiento de células adecuadas para análisis posteriores.
- Reproducibilidad demostrada del protocolo de aislamiento.
Conclusiones
- El protocolo descrito es eficiente para aislar células cerebrales de tejidos isquémicos.
- Este método puede aplicarse para estudiar el papel de diversos tipos celulares en la neuroinflamación.
- Estudios futuros pueden utilizar estas células aisladas para ensayos funcionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar células inmunitarias y cerebrales viables a partir de tejidos de ratón isquémicos permite desactivar mecanismos de riesgo de dianas neuroinflamatorias en la investigación del accidente cerebrovascular. Este protocolo facilita la validación de dianas al proporcionar poblaciones celulares purificadas para ensayos funcionales, reduciendo la ambigüedad en la interrogación de vías. El método mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al garantizar el aislamiento reproducible de infiltrados inmunitarios relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de células inmunitarias infiltradas a partir de lesiones cerebrales isquémicas.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo estandarizado para obtener poblaciones de células inmunitarias y validar la interacción con el blanco en modelos de neuroinflamación.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo mecanicista mediante el análisis cuantitativo de los fenotipos de las células inmunitarias tras la isquemia.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera suspensiones celulares purificadas adecuadas para citometría de flujo y cribado funcional de compuestos inmunomoduladores.
- Valor operativo: Asegura la eliminación de mielina y restos celulares mediante centrifugación en gradiente de densidad, mejorando las relaciones señal-ruido en los ensayos.
- Escalabilidad: Permite la preparación de entradas biológicas consistentes para perfiles inmunitarios de alto rendimiento en modelos de accidente cerebrovascular.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia patológica al aislar células directamente de tejidos isquémicos, preservando el contexto fisiopatológico.
- Valor operativo: Facilita la alineación translacional de biomarcadores al permitir el monitoreo inmunológico longitudinal en modelos preclínicos de accidente cerebrovascular.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de avance o interrupción al vincular la modulación del blanco con cambios medibles en las células inmunitarias in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta el perfilado preclínico, permitiendo cribados centrados en la respuesta inmunitaria y estudios mecanicistas posteriores en modelos de lesión isquémica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de células inmunitarias infiltradas en el cerebro para esclarecer las vías neuroinmunitarias en el accidente cerebrovascular.
- Cribado: Proporciona suspensiones celulares listas para ensayos con menor cantidad de restos celulares, mejorando la reproducibilidad en el cribado de compuestos basado en células inmunitarias.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, como la frecuencia de células inmunitarias y sus estados de activación, mediante citometría de flujo.
- Investigación Traductiva: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al preservar el contexto tisular isquémico en las células aisladas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable para modelos de neuroinflamación en diversas áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Aumenta la confianza en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de neuroinflamación.
- Valor Operativo: Estandariza la preparación de células entre laboratorios, mejorando la reproducibilidad en los flujos de trabajo de perfilado inmune.
- Valor Estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance al vincular los efectos del objetivo con cambios inmunes cuantificables en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la Cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos neuroprotectores basada en datos de modulación inmune.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de disociación enzimática de tejidos y separación por gradiente de densidad.
- Depende del acceso a centrífugas, filtros para células y medios de gradiente para la eliminación de mielina y restos celulares.
- Necesita controles estandarizados de tiempo y temperatura para prevenir daño celular durante la digestión.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse a tejidos distintos del cerebro o a diferentes modelos de isquemia.
- Se encuentra limitado por la disponibilidad del tejido y la necesidad de procesamiento rápido tras la perfusión para preservar la viabilidad celular.
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Última actualización: 29 agosto 2026