Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:36 min. • July 8th, 2025
Tomemos una sección fija del hipocampo de rata que contiene una interneurona llena de biocitina, una molécula conjugada con biotina.
A continuación, agregue una solución que contenga proteínas bloqueadoras y un detergente no iónico para evitar la unión inespecífica y permeabilizar las neuronas.
Incubar con un anticuerpo primario dirigido a receptores cannabinoides específicos en las interneuronas.
Lavar con tampón para eliminar el exceso de anticuerpos.
Luego, agregue un colorante fluorescente conjugado con estreptavidina y un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo.
Durante la incubación, la estreptavidina se une fuertemente a la biocitina, lo que permite la visualización de la interneurona llena de biocitina, mientras que el anticuerpo secundario se dirige a los anticuerpos primarios unidos al receptor en las interneuronas.
Enjuague con tampón, eliminando las moléculas no unidas.
Ahora, monte la sección con medios de montaje acuosos. Coloque un cubreobjetos y séllelo.
Con un microscopio de fluorescencia, visualice la expresión de la interneurona llena de biocitina y el receptor cannabinoide, lo que permite analizar la morfología y la distribución del receptor de la interneurona.
Bloquee los tejidos con suero bloqueador al 10% durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, incube las secciones en el anticuerpo primario CB1R a temperatura ambiente durante la noche, para identificar la expresión del receptor cannabinoide tipo uno. Luego, lave las secciones cerebrales tres veces durante 10 minutos cada una en PBS 0.1 molares. La estreptavidina y el anticuerpo secundario al primer anticuerpo primario se agregan a la placa de pocillos y se mantienen durante la noche a cuatro grados centígrados.
Posteriormente, incube las secciones en colorante rojo de estreptavidina conjugado a cuatro grados centígrados durante la noche en la oscuridad para revelar la biocitina. Después de eso, lave las secciones del cerebro tres veces durante 10 minutos cada una en PBS molar. Para proteger la fluorescencia y facilitar la repintado en el futuro, monte las secciones en un medio de montaje de base acuosa y selle los bordes de los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.