Tinción inmunohistoquímica de la proteína S-100 en secciones de biopsia por succión rectal humana

Tome secciones fijas de biopsia por succión rectal humana con antígenos proteicos expuestos y peroxidasas endógenas inactivadas.

Agregue una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Reemplace la solución de bloqueo con anticuerpos primarios que se unen a la proteína de células gliales diana, S-100, un marcador de la enfermedad de Hirschsprung.

Retire los anticuerpos no unidos e incube con polímeros de peroxidasa para amplificar la señal.

Lavar para eliminar el exceso de polímero. Agregue anticuerpos secundarios que se unan a polímeros enzimáticos y anticuerpos primarios.

Elimine los anticuerpos no unidos y agregue un sustrato cromogénico.

Las peroxidasas reaccionan con el sustrato, formando un precipitado coloreado.

Enjuague para eliminar el exceso de precipitado.

Agrega un tinte para teñir los núcleos.

Lavar con una solución de etanol ácido para eliminar el exceso de tinte.

A continuación, deshidrate las secciones utilizando concentraciones crecientes de etanol seguidas de xileno.

Finalmente, monte y observe bajo un microscopio para visualizar la tinción que indica la presencia de la proteína diana.

Deseche el exceso de albúmina sérica bovina y etiquete las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés a 4 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague los portaobjetos con tres lavados de tres minutos en PBS y agregue 50 microlitros de potenciador de polímero a cada portaobjetos. Después de 20 minutos a 37 grados centígrados, lave los portaobjetos tres veces en PBS y agregue 50 microlitros de anticuerpo B secundario a cada sección de tejido.

Después de 30 minutos a 37 grados centígrados, enjuague las secciones con tres lavados de cinco minutos en PBS y agregue una gota de solución de trabajo DAB recién preparada a cada portaobjetos. Cuando se detecte el nivel apropiado de tinción marrón mediante microscopía óptica, enjuague los portaobjetos en PBS durante cinco minutos y contratiña los núcleos con una gota de hematoxilina durante un minuto.

Elimine el exceso de mancha bajo un chorrito de agua durante aproximadamente 30 a 40 segundos, seguido de un lavado de 25 a 30 segundos en PBS fresco. Diferencie los tejidos en etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 10 segundos, seguido de un lavado PBS de un minuto.

Deshidrate los portaobjetos con inmersiones de cinco minutos en el orden inverso de hidratación y exponga los portaobjetos a dos cambios de xileno de cinco minutos. A continuación, monte el cubreobjetos con un montaje ultralimpio y deje que los portaobjetos se sequen antes de su visualización en un microscopio óptico.