Inducción de lesiones neuronales selectivas utilizando un láser de alta potencia en una larva de Drosophila

Coloque una larva de Drosophila anestesiada con la cabeza hacia arriba sobre una gota de aceite en un portaobjetos de vidrio que contenga manchas de grasa al vacío.

Coloque un cubreobjetos y presiónelo suavemente para hacer contacto con la larva.

Ajuste la larva para exponer la región que contiene las neuronas diana que expresan proteínas fluorescentes.

Asegure el portaobjetos en un microscopio de dos fotones.

Use un láser de baja potencia para minimizar el daño y escanee la larva para localizar la región con las neuronas objetivo fluorescentes.

A continuación, ajuste la ventana de escaneo para enfocarse en la región objetivo que contiene axones, un tipo de proyecciones neuronales.

Ahora, reduzca la velocidad de escaneo y aumente la potencia del láser.

El láser de alta potencia golpeará los axones objetivo, generando calor localizado que los daña y mejora la fluorescencia alrededor del sitio de la lesión.

Finalmente, vuelva al modo láser de baja potencia. La presencia de pequeños cráteres en forma de anillo en el sitio de la lesión confirma una lesión neuronal exitosa.

Comience anestesiando las larvas. En una campana extractora, coloque un plato de vidrio de 60 milímetros en una placa de Petri de plástico de 15 centímetros. Luego, dobla un trozo de papel de seda y colócalo en el plato de vidrio. Coloque la placa de agar de uva sobre el tejido después de agregar el éter dietílico. A continuación, en un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de aceite de halocarbono 27 en el centro y coloque una mancha de grasa al vacío en cada una de las cuatro esquinas.

Luego, use fórceps para transferir una larva a la placa de agar y cubra el plato de vidrio para anestesiar la larva. Tan pronto como la larva deje de moverse, transfiérala con cuidado al aceite de halocarbono con la cabeza erguida. Luego, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y presiónelo suavemente hasta que toque la larva. A continuación, use una fuerza suave para deslizar el cubreobjetos para hacer rodar las células que se van a ablacionar hasta donde el láser de dos fotones las golpeará más fácilmente. La ubicación variará según las neuronas a las que se dirija.

Ahora, asegure el ensamblaje en la platina del microscopio de dos fotones y concéntrese en las células de interés utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40x. En el software, cambie al modo de escaneo y cargue el protocolo guardado. Asegúrese de que el orificio esté completamente abierto. Luego, en el modo Live, obtenga una buena imagen de la región de interés. A continuación, detenga el escaneo en vivo, para que el botón Recortar esté disponible. Con la función Recortar, ajuste la ventana de escaneo para enfocar el área objetivo solo en el sitio potencial de la lesión.

A continuación, abra una nueva ventana de imágenes. Ahora, reduzca la velocidad de escaneo y aumente la intensidad del láser. A continuación, active el botón continuo para iniciar y detener el análisis. Observe con atención. Tan pronto como haya un aumento drástico de la fluorescencia, finalice la exploración. A continuación, vuelva a la ventana de imágenes original, seleccione el modo En vivo y busque la región a la que se acaba de apuntar ajustando el enfoque.

Una buena indicación de una lesión exitosa es la aparición de un pequeño cráter, una estructura en forma de anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión. Si la potencia del láser fuera demasiado alta, se vería una gran área de daño, lo que puede ser letal.