Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:14 min. • July 8th, 2025
Las regiones del locus coeruleus, ubicadas bilateralmente en el tronco encefálico del ratón, contienen neuronas productoras de norepinefrina y regulan varias regiones del cerebro.
Para detectar estas regiones del locus coeruleus, comience con un portaobjetos de vidrio que lleve las secciones fijas y criopreservadas del tronco encefálico del ratón.
Lave el portaobjetos con un tampón para eliminar los restos de fijador.
Agregue un tampón que contenga detergente e incube para permeabilizar las membranas, luego lave.
Introducir anticuerpos primarios específicos para la enzima dopamina β-hidroxilasa, que convierte la dopamina en norepinefrina, un neurotransmisor.
Incubar para permitir que los anticuerpos interactúen con la dopamina β-hidroxilasa.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Luego, agregue anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos verdes e incube en la oscuridad.
Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios y luego se lavan.
Agregue medio de montaje a las secciones del cerebro, luego cubra y seque.
Observe los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.
La fluorescencia verde que representa las neuronas productoras de norepinefrina marcadas en las secciones del cerebro indica la presencia de regiones locus coeruleus.
El primer día, lave las rodajas de cerebro en la placa de 24 pocillos 3 veces durante 5 minutos cada una en PBS. Luego, agregue PBS al 0,5% con detergente y permeabilice a 4 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, lave las rodajas tres veces durante 5 minutos cada una con PBSD al 0,5%. Luego, agregue el anticuerpo primario a una dilución de 1 a 500 en PBSD al 0,5% e incube a 4 grados Celsius durante 18 horas.
El 3er día, lave las rodajas 3 veces durante 10 minutos cada una con PBSD al 0,5%. Luego, agregue el anticuerpo secundario a una dilución de 1 a 1,000 en PBSD al 0.5%. Envuelva el plato con papel de aluminio e incube a 4 grados centígrados durante 16 horas.
Después de la incubación, lave las rodajas 3 veces durante 5 minutos cada una con PBSD al 0,5% y luego durante 5 minutos en PBS. Cubra las secciones con un medio de montaje rígido sin DAPI. Cubrir con una tapa de vidrio y secar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, use un microscopio confocal con configuraciones para detectar la señal de la longitud de onda de fluorescencia apropiada, para obtener imágenes de cortes de cerebro.