Marcaje y trasplante de células de eminencia ganglionar medial medial para estudios in vivo

Recolecte el tejido de eminencia ganglionar medial, que contiene progenitores interneuronales corticales, de embriones de ratón modificados genéticamente.

Agregue un polímero catiónico y disocie el tejido en una suspensión unicelular.

Agregue vectores lentivirales que lleven un reportero de GFP dependiente de Cre recombinasa flanqueado por sitios lox. Incubar.

El polímero neutraliza las cargas de membrana viral y de la célula huésped, lo que permite la fusión viral y la liberación de ARN.

El ARN viral se transcribe de forma inversa y se integra en el genoma del huésped.

Centrifugar y desechar el sobrenadante. Absorbe el exceso de medios.

Transfiera las células a una superficie hidrofóbica y cárguelas en un dispositivo de inyección.

Inyecte las células en la corteza de un cachorro de ratón anestesiado.

Deja que el cachorro se recupere y crezca.

Los progenitores trasplantados se diferencian en interneuronas maduras en la corteza.

Un subgrupo de estas interneuronas coexpresa Cre recombinasa y RFP.

En estas interneuronas, Cre extirpa los sitios lox, invirtiendo el gen GFP y permitiendo su expresión.

Visualice la coexpresión de RFP y GFP para identificar interneuronas que expresan Cre.

Después de preparar lentivirus y diseccionar el MGE de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, recolecte ambos hemisferios del MGE y coloque el tejido en dos tubos de recolección de 1,5 mililitros que contienen 500 microlitros de DMEM con 10% de FBS.

Mantenga las muestras en hielo hasta que se recolecte todo el tejido. Luego transfiera los tubos a una campana con certificación BSL-2. Aspire cuidadosamente el medio sin alterar los tejidos MGE depositados en el fondo del tubo.

A continuación, añada unos 500 microlitros de DMEM precalentado con un 10% de medios FBS. Agregue polibreno a una concentración final de 8 microgramos por mililitro y valore a través de una punta de pipeta P1000 hasta lograr una suspensión unicelular. Luego, agregue de 15 a 20 microlitros del lentivirus concentrado a cada tubo.

A continuación, cierre bien cada tubo, inviértalo para mezclar y luego coloque todos los tubos en una incubadora a 37 grados centígrados. Incube las células con el lentivirus durante al menos 30 minutos, pero no más de una hora, ya que los tiempos más largos han resultado en una disminución de la viabilidad celular. Invierta los tubos cada 10 minutos.

Después de la incubación, retire los tubos de la incubadora y centrifugue a 700 veces g a 4 grados centígrados durante tres minutos para granular las células. En la campana BSL-2, retire el sobrenadante y deséchelo en lejía al 10%. A continuación, agregue 1 mililitro de DMEM con 10% de FBS y titule el gránulo dos o tres veces para lavarlo.

Después de centrifugar como antes, repita este paso de lavado dos o tres veces más para eliminar el exceso de virus. Después del lavado final, retire la mayor cantidad de medios posible y coloque cada tubo en hielo.

Debido a los medios residuales en los lados del tubo, aproximadamente de 2 a 3 microlitros de medios terminarán cubriendo el sedimento celular, para cuando comience el procedimiento de trasplante. Mientras se asegura de que se utilice la técnica estéril en todo momento, extraiga aceite mineral en una jeringa de 1 mililitro y luego con una aguja de calibre 30,5, rellene completamente la pipeta de vidrio con el aceite mineral.

A continuación, coloque la pipeta de vidrio en el dispositivo estereotáxico y cárguela en el émbolo. Con un asistente que utilice el accionamiento hidráulico, mueva el émbolo hasta la mitad de la pipeta de vidrio, eliminando el aceite mineral que se derrama con una toalla de papel limpia.

A continuación, gire la esquina de una toalla de papel estéril en una punta fina y utilícela para eliminar delicadamente el exceso de medios por encima del gránulo de células MGE. Esto concentrará la densidad celular para que se puedan lograr volúmenes de inyección más pequeños.

A continuación, utilice una pipeta P2 para extraer lentamente el gránulo celular y valorar una o dos veces antes de dispensar sobre una superficie hidrofóbica. El volumen debe ser de poco menos de 1 microlitro.

Mueva la punta de la aguja hacia la suspensión celular y, con el accionamiento hidráulico, extraiga la suspensión celular hacia la pipeta. Después de anestesiar a un cachorro mediante hipotermia, verifique la efectividad de la anestesia pellizcando la piel entre los dedos de los pies con fórceps. No se debe ver ninguna reacción.

Luego, coloque al cachorro en un molde que esté debajo del dispositivo de inyección y tensa la piel tirando hacia atrás de la piel de la cabeza y luego asegurándola con cinta de laboratorio estándar. Trabajando rápidamente, manipule el brazo estereotáxico para colocar la punta de la pipeta de vidrio en la cabeza del cachorro, perpendicular a la superficie de la cabeza.

Cuando la pipeta esté en contacto con el cabezal, considérelo un cero. A continuación, empuje la pipeta a través de la superficie de la piel y el cráneo hacia la corteza. A continuación, inserte y retraiga la pipeta dos veces antes de detenerla.

Para apuntar a las células en el neocórtex, las inyecciones se realizan cuando la micropipeta está a una profundidad de 0,1 milímetros. Una vez que la aguja esté en posición, gire el dispositivo hidráulico para hacer avanzar el émbolo hacia la pipeta de vidrio e inyecte de 50 a 70 nanolitros por sitio.

Repita este procedimiento en tres a seis sitios diferentes a diferentes niveles rostral-caudal si se requiere una amplia distribución de células transformadas en todo el neocórtex. Cuando se completen las inyecciones, retire al cachorro del escenario y márquelo de acuerdo con los procedimientos aprobados.

Una vez que el cachorro se haya recuperado y pueda moverse por sí solo, vuelva a colocarlo con la hembra lactante y el resto de la camada. Revise a los cachorros después del procedimiento y al día siguiente, para asegurarse de que no haya signos de deterioro de la salud.