JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
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Comience con un inserto de membrana que contenga células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón, que se asemeja a una barrera hematoencefálica in vitro.
Coloque este inserto en un pozo de resistencia eléctrica transendotelial o instrumento TEER que contenga un electrodo incrustado.
Agregue medios nuevos al compartimento inferior.
Coloque la tapa con electrodos sobre los pocillos TEER, luego coloque el instrumento en una incubadora y conéctelo a un sistema de registro.
Los electrodos generan una corriente eléctrica a través de la capa celular para medir la resistencia transendotelial.
Las proteínas de unión intactas entre las células impiden el flujo de corriente, lo que resulta en un valor TEER más alto.
Desconecte el instrumento y retírelo.
Desmonte la tapa, retire un poco de medio del compartimento superior y agregue células T preactivadas. Vuelva a montar el instrumento para la medición TEER.
Las células T activadas interactúan con las células endoteliales, liberando factores inflamatorios y enzimas citolíticas, alterando la integridad de la unión.
Esta interrupción aumenta el flujo de corriente eléctrica, lo que resulta en un valor TEER más bajo.
Para configurar la medición TEER, coloque el módulo de 24 pocillos del instrumento TEER en la campana de flujo laminar. Retire los párpados y coloque los insertos con MBMEC en el instrumento con fórceps.
A continuación, pipetee 810 microlitros del medio fresco al compartimento inferior de los pocillos del módulo. Agréguelo con cuidado entre el inserto y la pared del pozo del módulo. Después de eso, cierre las tapas y coloque el instrumento en la incubadora. Conecte el instrumento a la computadora. Luego, encienda el controlador de instrumentos y abra el software.
En la ventana emergente, seleccione 'Nueva medición'. Marque las casillas 'Mostrar TEER' y 'Mostrar Ccl', luego presione 'Iniciar'. Después de completar la primera medición, seleccione 'Verificar todos los pocillos' en la pestaña 'resultados' para ver todos los valores de TEER y Ccl. Luego guarde el archivo.
A continuación, elija el punto de tiempo para cocultivar MBMEC con células T cuando Ccl es estable y inferior a 1 microfaradio por centímetro cuadrado y TEER ha alcanzado su nivel máximo. Inspeccione cuidadosamente los valores absolutos de TEER y Ccl, y excluya los pozos en los que los MBMEC no hayan desarrollado monocapas lo suficientemente confluentes desmarcando dichos pozos.
Agrupe el resto de los pozos haciendo clic derecho en los pozos y seleccionando 'Agregar pozo al nuevo pozo promedio'. Nómbrelo en la ventana emergente y haga lo mismo para todos los pozos individuales que se agruparán. Luego, verifique todos los pozos promedio para confirmar que todos tengan las mismas condiciones iniciales antes del cocultivo.
En la pestaña 'Experimento', presione 'Pausa'. Desconecte el instrumento y sáquelo de la incubadora. Luego, retire las tapas de la campana de flujo laminar. Posteriormente, retire parte del medio del inserto en el compartimiento superior del pozo. Agregue células T a los MBMEC pipeteando cuidadosamente 150 microlitros de medio. Luego, vuelva a conectar el instrumento y presione 'Reanudar medición'. Después de 24 horas, presione 'Detener' en la pestaña 'Experimento' y guarde el archivo.