Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:58 min. • July 8th, 2025
Tome una sección fija del cerebro de ratón que contiene el núcleo basal de Meynert, rico en fibras nerviosas que expresan la enzima colina acetiltransferasa.
La sección se trata previamente para desactivar la peroxidasa endógena.
Agregue un detergente para permeabilizar las membranas celulares, seguido de una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Reemplace la solución con anticuerpos primarios que se unan a la colina acetiltransferasa.
Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos. Incubar con anticuerpos secundarios marcados con biotina, que se unen a los anticuerpos primarios.
Elimine los anticuerpos no unidos y agregue complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios.
Lavar para eliminar el exceso de complejos.
Agregue un sustrato cromogénico que reaccione con la peroxidasa, formando un precipitado coloreado.
Enjuague con agua destilada para eliminar el exceso de precipitado.
Transfiera la sección a un portaobjetos gelatinizado.
A continuación, deshidrate la sección utilizando concentraciones crecientes de etanol, seguido de xileno.
Monte la sección y observe bajo un microscopio para visualizar las fibras nerviosas teñidas.
Para el marcaje inmunohistoquímico de las secciones de tejido, después de bloquear cualquier unión inespecífica con suero bovino normal al 10% en Triton X-100 al 0,1%, en solución salina tamponada con tris, marque las secciones con el anticuerpo primario de interés, durante 48 horas a cuatro grados Celsius.
Al final de la incubación, lave las secciones tres veces, durante tres minutos, en solución salina fresca tamponada con tris por lavado. Seguido de incubación con un anticuerpo secundario biotinilado apropiado, durante una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las secciones tres veces en solución salina fresca tamponada con tris, como se demostró. Seguido de tinción con complejo avidina-biotina-peroxidasa y solución de sustrato de peroxidasa DAB, según los protocolos del fabricante.
Después del lavado, monte todas las secciones de una muestra de tejido cerebral en un portaobjetos gelatinizado. Deje que las muestras se sequen al aire. Para deshidratar las secciones, sumerja las muestras dos veces, durante cinco minutos por dilución, en soluciones de etanol ascendentes secuenciales, como se indica, seguido de un aclarado con dos lavados de xileno de 10 minutos. Luego, use un medio de montaje apropiado para colocar cubreobjetos en las guías.