Medición de la absorción de dopamina en sinaptosomas cerebrales de ratón utilizando dopamina radiomarcada

Cosecha sinaptosomas, estructuras unidas a la membrana derivadas de las terminales presinápticas intactas de las sinapsis neuronales que contienen transportadores de dopamina (DAT), de un cerebro de ratón.

Llene los tubos de ensayo con tampón que contenga ligandos y los tubos de referencia con tampón que contenga ligandos y un inhibidor de DAT.

Agrega los sinaptosomas.

Los ligandos inhiben las enzimas degradadoras de la dopamina y otros transportadores, evitando la degradación de la dopamina y la absorción inespecífica.

Introducir dopamina no marcada y radiomarcada.

En la condición de prueba, el DAT sinaptosómico absorbe la dopamina.

En la condición de referencia, el inhibidor previene la captación de dopamina mediada por DAT, permitiendo solo la captación de fondo.

Agregue las muestras a filtros de microfibra que retienen los sinaptosomas.

Lavar para eliminar la dopamina no unida.

Transfiera los filtros a los tubos de centelleo.

Agregue líquido de centelleo que contenga un compuesto radiosensible.

Coloque los tubos en un mostrador de centelleo.

Las emisiones radiactivas de la dopamina excitan el compuesto para emitir luz, que se mide con el contador.

Reste la referencia de los datos de la prueba para medir la absorción de dopamina sinaptosómica.

En este paso, agregue 440 microlitros de tampón de absorción, ligando y cocaína a 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros designados y 440 microlitros de tampón de absorción y ligando a los 36 tubos de microcentrífuga restantes de 1,5 mililitros. Etiquete 6 tubos de microcentrífuga de 2 mililitros como 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 y 0.31. Luego agregue 750 microlitros de tampón de absorción y ligando a los 5 tubos de microcentrífuga con el número más bajo.

A continuación, agregue 1,455.4 microlitros de tampón de absorción y ligando, 14.6 microlitros de dopamina sin marcar y 30 microlitros de dopamina tritiada al tubo etiquetado como 10. A continuación, transfiera 750 microlitros de la mezcla del tubo etiquetado como 10 al tubo etiquetado como 5. Mezcle bien y transfiera 750 microlitros de la mezcla de este tubo al tubo etiquetado como 2.5. Repita esta dilución con los tubos restantes.

Después de eso, enjuague previamente los filtros de microfibra de vidrio con 4 mililitros de tampón de absorción después de colocarlos en un cubo de filtro de 12 pocillos. A continuación, agregue 10 microlitros de la suspensión de membrana sinaptosomal a los primeros 24 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contienen 440 microlitros de tampón. Agite el vórtice con cuidado y gire hacia abajo brevemente para asegurarse de que los sinaptosomas estén sumergidos en el búfer.

Luego, déjalos a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos, agregue 50 microlitros de dopamina de 10 micromolares y 5 micromolares a las primeras 2 columnas, y déjelas a 37 grados centígrados durante 5 minutos agitando. Después de 5 minutos, detenga la reacción agregando 1 mililitro de tampón de absorción helada. Repítelo con el micromolar 2.5 y el micromolar 1.25, y luego con el micromolar 0.62 y el micromolar 0.31.

Agregue las muestras a los filtros de microfibra previamente enjuagados y lávelas con 5 x 4 mililitros de tampón de absorción de hielo frío. Después de agregar las primeras 12 muestras a los filtros, mueva los filtros a los tubos de centelleo. Repita esto con las siguientes 12 muestras. Prepare 3 tubos de conteo máximo colocando un filtro de microfibra en la parte inferior de los tubos de centelleo 49 a 51 y agregando 25 microlitros de la dopamina máxima de 10 micromolares en la parte superior.

Después de esto, deje los 51 tubos de centelleo en una campana extractora durante 1 hora. Luego, agregue 3 mililitros de líquido de centelleo a cada tubo de centelleo y agite vigorosamente en un agitador durante 1 hora. Para contar la dopamina tritiada en un contador beta durante 1 minuto, abra el programa y elija la configuración adecuada. Para la determinación de proteínas, utilice un kit de ensayo de proteínas BCA estándar para determinar las concentraciones de proteínas de los sinaptosomas para ajustes y para una comparación adecuada de la absorción entre muestras.