Marcaje de interneuronas llenas de biocitina en rodajas de hipocampo de rata para su visualización

Tome rodajas fijas y permeabilizadas de hipocampo de rata que contengan interneuronas llenas de biocitina con peroxidasas endógenas inactivadas.

Agregue complejos de avidina-biotina (ABC) que contengan peroxidasa de rábano picante (HRP) e incube, permitiendo que la avidina se una a la biocitina.

Lave el ABC sin ligar.

Agregue una mezcla de sustrato cromogénico y potenciador de metales, luego incube.

Introducir peróxido de hidrógeno para activar el HRP, que oxida el sustrato para formar un precipitado oscuro, mientras que el potenciador mejora el contraste.

Transfiera las rodajas al papel de filtro y elimine el exceso de tampón. Tratar con tetróxido de osmio para mejorar el contraste.

Coloque las rodajas en un portaobjetos y móntelos. Deshidratarlos aumentando las concentraciones de etanol.

Lavar las rodajas en etanol absoluto y óxido de propileno.

Agrega resina para infiltrar los tejidos.

Coloca las rodajas en una plancheta y calienta para polimerizar la resina. Transfiera las rodajas a un portaobjetos, coloque un cubreobjetos y solidifique la resina.

Usando microscopía óptica, visualice las interneuronas llenas de biocitina teñidas de oscuro.

Coloque las secciones en un frasco de vidrio limpio que contenga PBS. Realice la reacción HRP de avidina incubando primero las secciones en el complejo de biotina avidina, o ABC, durante al menos dos horas para amplificar el producto de reacción HRP.

A continuación, lave las secciones con PBS 3 veces durante 10 minutos y luego con tampón Tris dos veces durante 10 minutos. Después de eliminar el último lavado tampón de trazas, agregue rápidamente 1 gota de solución de cloruro de níquel al 8% a la solución de diaminobenzidina o solución DAB. Luego pipetea la solución hacia adentro y hacia afuera para mezclar.

Y agregue rápidamente 1 mililitro de esta solución sobre las secciones. Incube las secciones en esta solución durante 15 minutos. Luego, agregue 10 microlitros de peróxido de hidrógeno al 1% a la solución DAB. Deje que la reacción continúe en la oscuridad bajo agitación constante durante aproximadamente 1 a 2 minutos, hasta que las células estén marcadas.

En una campana extractora, coloque un pequeño círculo de papel de filtro en una placa de Petri y humedézcalo con PB. Levante las secciones una a la vez del frasco de vidrio con un pincel y colóquelas con cuidado sobre el papel. Cubra las secciones con otro círculo humedecido de papel de filtro. Y elimine el exceso de tampón tocando suavemente el papel de seda con la superficie.

Aplique 8 o 9 gotas de tetróxido de osmio al 1% en PB en el papel superior. Cubra el plato y manténgalo en la campana extractora durante al menos 30 minutos, pero no más de una hora. Después de enjuagar, montar y cubrir las secciones, deshidrate a través de una serie de soluciones de alcohol al 50%, 70%, 95% y 100%.

Después del paso de deshidratación, transfiera las secciones a un vial de vidrio que contenga etanol al 100% en un agitador durante aproximadamente 5 minutos. Reemplace la solución de alcohol con óxido de propileno y lave tres veces durante 5 minutos. Después del último lavado, mantenga alrededor de 2 mililitros de óxido de propileno en el vial y agregue resina en una proporción de uno a uno.

Asegúrese de que la resina se disuelva y mantenga las secciones bajo agitación constante durante 30 minutos. Después de 30 minutos, use un palo de madera para colocar cada sección en una plancheta de aluminio que contenga resina epoxi e incube durante la noche. Al día siguiente, coloque la plancha en una placa caliente durante aproximadamente 10 minutos.

Luego, recoja cada sección con un palo de madera y colóquela en un tobogán limpio. Una vez que todas las secciones se hayan transferido al portaobjetos, vea el portaobjetos bajo un microscopio de disección para verificar la orientación de las rodajas y coloque un cubreobjetos sobre las secciones. Curar en el horno durante 48 horas a 56 grados centígrados.