Hibridación in situ mediante sondas de oligonucleótidos para estudiar la expresión de ARN en secciones de cerebro de rata

Tome secciones cerebrales fijas de una rata con síndrome serotoninérgico, lo que conduce a una síntesis alterada de ARN del receptor de serotonina en las neuronas.

Deshidratar el tejido con alcohol. Aplicar una solución de pretratamiento para desactivar las enzimas hidrolizantes endógenas, evitando su interacción con los reactivos de detección.

Tratar con un tampón hirviendo para romper los enlaces cruzados inducidos por la fijación, exponiendo los ARN diana.

Deshidratar el tejido, dibujar una barrera hidrofóbica e incubarlo con una solución para permeabilizar las membranas celulares.

Agregue sondas de oligonucleótidos e incube, lo que permite que las sondas se hibriden con los ARN diana.

Lave para eliminar las sondas no unidas, luego incube con reactivos de amplificación que contengan sondas de preamplificador, amplificador y etiqueta conjugada con enzimas que se unen a las sondas de oligonucleótidos.

Incubar con sustratos cromogénicos que son hidrolizados por las sondas conjugadas con enzimas, produciendo color visible.

Trate con xileno para aumentar la transparencia del tejido, agregue un medio de montaje y aplique un cubreobjetos.

Bajo un microscopio, las manchas de colores en el tejido ayudan a cuantificar la expresión de ARN objetivo.

En este procedimiento, para la deshidratación, tome cuatro portaobjetos para cajas de portaobjetos de microscopio almacenados en el congelador a 80 grados Celsius negativos. Asigne las secciones a las pruebas de los genes ppiB, dapB y ht2a. Márquelos y etiquételos con un bolígrafo.

A continuación, sumerja los portaobjetos en alcohol 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, seque los portaobjetos durante cinco minutos en la campana extractora. Para el pretratamiento, pipetee 20 microlitros del pretratamiento un reactivo a cada sección.

Coloque las diapositivas en un riel de rejilla en una bandeja de humedad. Agite suavemente la bandeja de humedad en un agitador horizontal a baja velocidad durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitados de 1.000 mililitros que contenga 450 mililitros del reactivo de pretratamiento 2.

A continuación, hierva los portaobjetos durante un total de cinco minutos a 100 grados centígrados para restaurar la estructura del ARN. Después de eso, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos cada vez. Coloque los portaobjetos en alcohol 100% durante cinco minutos.

Luego seque las diapositivas durante cinco minutos en la campana extractora. Use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido. Posteriormente, pipetee 10 microlitros del reactivo de pretratamiento en cada área seleccionada para aumentar la penetración de la sonda y cubra la bandeja de humedad con una tapa.

A continuación, coloque la bandeja en el horno de hibridación equipado con una coctelera horizontal. Ajuste la temperatura del horno a 40 grados centígrados y agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Luego, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos cada vez.

En este paso, pipetee 10 microlitros de sonda ppiB, dapB o htr2a en las áreas seleccionadas. Luego, cubra la bandeja de humedad con una tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente los portaobjetos en la coctelera horizontal a baja velocidad mientras los incuba a 40 grados centígrados en el horno durante dos horas.

A continuación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez. Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 1 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez.

Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 2 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 15 minutos. Después de eso, lave los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante dos minutos cada vez.

Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 3 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 30 minutos. Luego lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos.

Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 4 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos.

Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 5 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos.

Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación 6 en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, lave los portaobjetos nuevamente dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez.

Ahora, pipetea 10 microlitros del reactivo rojo en cada área seleccionada. Coloque los portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a temperatura ambiente y agite suavemente a baja velocidad durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante 10 minutos cada vez.

Seque los portaobjetos a 60 grados centígrados en el horno durante 15 minutos. Después de eso, coloque los portaobjetos en xileno en la campana extractora durante cinco minutos. A continuación, pipetee 20 microlitros de medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cúbralos con un cubreobjetos.