Tinción de fluorescencia de células de cresta neural cultivadas en hidrogeles de diversa rigidez

Tome cultivos de células de cresta neural adherentes cultivados en cubreobjetos recubiertos con hidrogeles de rigidez variable. Lave las células con tampón.

Agregue paraformaldehído para fijar las células y preservar la morfología celular.

Lave las células con tampón para eliminar el exceso de paraformaldehído.

A continuación, agregue un detergente no iónico para permeabilizar las membranas celulares.

Lave las celdas con tampón para eliminar el exceso de detergente.

A continuación, introduzca una solución de bloqueo para evitar el enlace no específico.

Incube las células con una sonda de actina filamentosa de alta afinidad que se une a los filamentos de actina.

Lave las celdas con tampón para eliminar las sondas sueltas.

Agregue un tinte nuclear fluorescente para teñir los núcleos, luego lave con tampón para eliminar el exceso de tinte.

Aplique medios de montaje a los cubreobjetos y examine las células teñidas bajo un microscopio de fluorescencia.

Las células cultivadas en hidrogeles más rígidos muestran una mayor formación de filamentos de actina y una morfología más extendida que las cultivadas en hidrogeles más blandos.

Use pinzas para transportar los cubreobjetos a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células que crecen directamente en la placa. Luego, fije las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, antes de tratar las células con 500 microlitros de Triton X-100 al 0,1% a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, bloquee las células con 250 microlitros de suero de burro al 10%. Tiñir las células para F-actina con faloidina en una dilución de 1 a 400 en 250 microlitros de suero de burro al 10%, seguido de incubación con DAPI durante 10 minutos.

Lave las celdas con PBS durante dos minutos antes de agregar de tres a cuatro gotas de medio de montaje a cada pocillo. En un microscopio de fluorescencia, capture las imágenes de al menos tres fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel que produzcan canales individuales y combinados.