Evaluación de la absorción de glucosa en las neuronas motoras de larvas de Drosophila con metabolismo de glucosa regulado al alza

Coloque las larvas de Drosophila de control y mutantes en platos separados que contengan un tampón sin glucosa.

Diseccione las larvas para extirpar los órganos internos, exponiendo el sistema nervioso central o SNC.

El SNC incluye un cordón nervioso ventral que alberga neuronas motoras. En las larvas mutantes, estas neuronas exhiben un metabolismo de la glucosa regulado al alza.

Las neuronas motoras de ambos grupos expresan sensores de glucosa intracelulares que contienen fluoróforos donantes y aceptores.

Coloque las larvas bajo un microscopio confocal. Tras la excitación, el fluoróforo donante emite fluorescencia.

Localice las neuronas motoras usando esta fluorescencia.

Reemplace el tampón con una solución suplementada con glucosa.

La glucosa ingresa a las neuronas, se une a los sensores y desencadena un cambio conformacional que acerca los dos fluoróforos.

Tras la excitación, el aceptor absorbe la energía emitida por el donante, denominada transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o FRET, y emite fluorescencia.

La señal FRET se correlaciona con la absorción de glucosa. Una mayor intensidad de señal aceptora en las larvas mutantes en comparación con el control indica un metabolismo de la glucosa regulado al alza.

Antes de comenzar las disecciones, encienda el microscopio de imágenes y los láseres. Luego, recolecte una larva errante de tercer estadio. Enjuáguelo con agua doble destilada y colóquelo en una gota de tampón HL3 en un plato forrado con elastómero previamente preparado.

Luego, bajo un microscopio de disección, use un par de fórceps para sujetar los extremos anterior y posterior de la larva, con la dorsal hacia arriba, estirando cuidadosamente la larva a lo largo con alfileres de insectos. Con un par de tijeras de iris en ángulo, haga una incisión justo encima del pasador posterior. Luego haga un corte vertical desde la incisión hacia el extremo anterior de la larva.

Después de agregar unas gotas de tampón HL3, si es necesario, retire la tráquea y el resto de los órganos flotantes sin alterar el sistema nervioso central. Luego, sujete las solapas, estirando la pared del cuerpo, para exponer el sistema nervioso central mientras mantiene intacto el sistema neuromuscular.

Para la adquisición de imágenes, utilice un microscopio confocal vertical con una lente de inmersión en agua 40 veces. Luego, seleccione el láser de 405 nanómetros para excitar el CFP. A continuación, optimice los parámetros de adquisición, como la velocidad de escaneo, el promedio, el objetivo, el tamaño estenopeico del zoom y la resolución espacial. Ajuste la ganancia de modo que la señal esté en el rango dinámico óptimo y use los mismos parámetros para todos los genotipos.

Para obtener imágenes de las neuronas motoras dentro del cordón nervioso ventral, coloque el plato de silicona con la muestra diseccionada debajo de la lente y baje la lente para que entre en contacto con la sacarosa trehalosa HL3. Asegúrese de que la lente esté completamente sumergida en el búfer y agregue más búfer si es necesario.

A continuación, utilizando los canales CFP y FRET, seleccione manualmente una selección óptica que consta de al menos 6 neuronas motoras enfocadas, ubicadas a lo largo de la línea media del cordón nervioso ventral. Luego, adquiera imágenes cada 10 segundos o 10 minutos. Estas imágenes representan la línea de base.

Para la estimulación de la glucosa, retire el tampón HL3 que contiene sacarosa trehalosa con una pipeta Pasteur y agregue un tampón HL3 suplementado con glucosa de 5 milimolares sin mover el cordón nervioso ventral. Luego, adquiera imágenes cada 10 segundos durante otros 10 minutos.

Estas imágenes representan la fase de estimulación. Guarde las imágenes como archivos dot czi o cualquier tipo de archivo compatible con el software de imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha, los antecedentes genéticos, la condición experimental y los canales utilizados. Reutilizó los parámetros para obtener imágenes de todos los genotipos.