Microdisección de captura láser para aislar células de Purkinje de un tejido de cerebelo humano post-mortem

Tome un tejido cerebeloso humano postmortem que contenga las células de Purkinje, el gránulo y las capas de células moleculares.

Colóquelo en un soporte de muestra de criostato que contenga medios de inclusión parcialmente congelados.

Deje que el medio se congele por completo, asegurando el tejido.

Transfiera este conjunto al brazo de corte del criostato y permita que el tejido se aclimate a la temperatura del criostato.

Acerque el tejido a la cuchilla y recórtelo para exponer las capas de la corteza.

Coloque una placa antivuelco sobre la hoja y obtenga secciones cerebelosas.

Transfiera estas secciones a un portaobjetos de membrana.

Incubar en concentraciones crecientes de etanol para la fijación y deshidratación de tejidos.

Luego, incube en xileno.

Seque el portaobjetos y colóquelo en una platina de microscopio de captura láser UV.

Coloque la tapa de recolección sobre el tejido cerebeloso.

Microscópicamente, concéntrese en las células de Purkinje.

Usando el láser, capture y recolecte las células de Purkinje para su posterior análisis.

Primero, corte un pequeño trozo de tejido para seccionarlo, asegurándose de que la sección sea aproximadamente 95% de corteza cerebelosa. Regrese el tejido restante al hielo seco o a un congelador a menos 80 grados centígrados. A continuación, comience a agregar lentamente OCT en la parte superior del mandril con un movimiento circular lento. Acumule capas de OCT hasta que haya un montículo, de aproximadamente tres milímetros de altura que cubra el mandril.

Cuando la OCT esté parcialmente congelada, pero aún tenga algo de líquido en el centro, coloque los tejidos encima del montículo. Deje reposar los pañuelos sobre la OCT durante 1 a 2 minutos hasta que esté completamente congelada. Luego, transfiera el mandril con la OCT congelada y el tejido al brazo de corte del criostato. Ajuste el pañuelo para que quede al ras con la cuchilla de corte y deje reposar los pañuelos en el brazo de corte durante 20 minutos para que se ajusten a la nueva temperatura.

El paso más crítico es permitir que el tejido se aclimate en el brazo de corte del criostato durante el tiempo que sea necesario. Si el tejido se tritura, la visualización de las células de Purkinje será muy difícil. Recomiendo usar trozos de tejido más pequeños y delgados para permitir que el tejido se aclimate más rápido.

Después de esto, acerque lentamente el tejido a la hoja. Una vez que el tejido haya llegado a la cuchilla, comience el proceso de recorte. Recorta el tejido de 2 a 3 veces hasta que las capas de la corteza sean visibles.

A continuación, coloque y alinee la placa antivuelco justo encima de la cuchilla del criostato. Corte de 4 a 6 secciones de 14 micrómetros de grosor, teniendo en cuenta que las secciones cortadas correctamente quedarán planas debajo de la placa antivuelco. Alinee las secciones cortadas horizontalmente a lo largo de la etapa de criostato.

Inclina un portaobjetos para recoger todos los trozos de tejido, simultáneamente. Inmediatamente después de seccionar el tejido, coloque el portaobjetos en un portaobjetos con etanol al 70% en hielo durante 2 minutos. Transfiera el portaobjetos a un soporte para portaobjetos con etanol al 95% en hielo durante 45 segundos.

A continuación, coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos con etanol al 100% a temperatura ambiente durante 2 minutos. Sumerja el portaobjetos 3 veces en el soporte del portaobjetos que contiene xileno número 1 a temperatura ambiente. Luego, coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos con xileno 2 a temperatura ambiente durante 5 minutos. Coloque las diapositivas en una campana extractora limpia y déjelas secar al aire durante al menos 30 minutos.

Primero, use ARNasa descontaminada para limpiar la platina del microscopio en el brazo de recolección de tapas. Con las manos enguantadas, coloque el portaobjetos en el microscopio y una tapa opaca de 500 microlitros en el brazo de recolección. Con un aumento bajo, alinee la tapa opaca sobre el tejido cerebeloso, asegurándose de que la tapa cubra toda el área que se visualiza en el ocular.

Use un objetivo de 5 a 10 veces para visualizar las capas cerebelosas. Coloque el cursor sobre la sección donde se cruzan la capa molecular y la capa de células granulares. Muévase a un aumento de 40 veces y visualice las celdas de Purkinje. Luego, comienza a capturarlos.