Obtención de una suspensión unicelular a partir de tejido cerebral de rata congelado

Descongele una sección de tejido cerebral de rata congelado.

Agregue tampón y pique el pañuelo. Luego, transfiéralo a un tubo que contenga tampón y mezcle.

Centrifugar la mezcla y desechar el sobrenadante.

Agregue una solución de enzima proteolítica al tejido y vuelva a suspenderla con una pipeta de gran diámetro.

Incube la mezcla para descomponer la matriz extracelular, aflojando las células neuronales.

Centrifugar la mezcla y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender los fragmentos de tejido en un tampón enfriado y pipetee repetidamente para disociar las células.

Deje que los desechos y las células no disociadas se asienten, luego transfiera la suspensión de una sola célula a un nuevo tubo.

Transfiera las celdas a etanol helado y mezcle. Incubarlos para fijar y permeabilizar las células.

Centrifugar la suspensión y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células neuronales en un tampón frío para su posterior análisis.

Para picar el tejido, deje que las muestras se descongelen en una placa de vidrio fría durante no más de 1 minuto antes de cubrir las muestras con una o dos gotas de solución tampón A. A continuación, sosteniendo una hoja de afeitar completamente vertical a la placa, pique el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal. Para picar bien el tejido, es fundamental mantenerlo húmedo con tampón A y seguir los tiempos y la dirección de picado especificados.

Es fundamental eliminar la mayor parte de la materia blanca durante la disección del tejido y mantener el tejido cubierto con tampón A, para mejorar la eficiencia de la picación y mantener la salud de las células.

Cuando el tejido se haya procesado a fondo, use la cuchilla de afeitar para transferir las piezas a un tubo de microcentrífuga que contenga 1 mililitro de tampón frío A e invierta el tubo de tres a cinco veces para sumergir todo el tejido picado en la solución. Para disociar los fragmentos de tejido en una sola suspensión celular, granular las muestras por centrifugación.

Deseche el sobrenadante, luego agregue lentamente 1 mililitro de solución enzimática fría recién descongelada por la pared interna del microtubo y use una pipeta de gran diámetro de punta para aspirar y dispensar inmediatamente la totalidad de cada gránulo cuatro veces para dispersar los trozos de tejido picados. A continuación, invierta rápidamente el microtubo para evitar que los gránulos se peguen a los fondos de los tubos e incube la muestra con una mezcla de extremo a extremo durante 30 minutos a 4 grados centígrados.

Al final de la digestión, centrifugar el tubo nuevamente y agregar 0,6 mililitros de tampón frío A a las celdas. Con la misma punta de pipeta, aspire y dispense inmediatamente los gránulos cinco veces, luego seleccione una pipeta de vidrio de 1,3 milímetros y utilícela para valorar suavemente las muestras 10 veces.

Coloque la muestra en hielo durante 2 minutos para permitir que los desechos y las células no disociadas se asienten en el fondo del tubo. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros. Luego, transfiera 800 microlitros de células del primer tubo de sobrenadante recolectado a cada uno de los dos primeros tubos de etanol.

Invierta los tubos para mezclar las muestras. Luego coloque las muestras en hielo durante 15 minutos con mezcla por inversión cada 5 minutos. Al final de la incubación, centrifugar las células. Luego, tocando solo la pared del microtubo, use una micropipeta para eliminar lentamente todos menos los últimos 50 microlitros de cada sobrenadante.