Inducción de un accidente cerebrovascular de la sustancia blanca en un modelo murino utilizando un inhibidor de óxido nítrico

Comience con un ratón anestesiado inmovilizado en un marco estereotáctico con un cráneo expuesto.

Marque el bregma, luego taladre un agujero, comenzando posteriormente en el bregma y extendiéndose anteriormente, justo a la izquierda de la línea media.

Retire las capas de tejido para exponer la corteza cerebral mielinizada rica en axones y aplique gotas de solución salina para evitar que el tejido se seque.

Conecte una pipeta llena de un inhibidor de óxido nítrico a un brazo inyector, que se coloca en ángulo para una inyección precisa.

Ajuste las coordenadas estereotácticas e inyecte el inhibidor en la sustancia blanca de la corteza cerebral, sosteniendo la pipeta brevemente para evitar el reflujo.

Retraiga y repita la inyección en otras coordenadas.

Más tarde, selle el orificio y cierre la incisión con adhesivo.

Los inhibidores se unen a las enzimas productoras de óxido nítrico en las células endoteliales de los vasos sanguíneos, inhibiendo la producción de óxido nítrico y constriñendo los vasos sanguíneos.

Esta constricción inhibe el flujo sanguíneo, lo que provoca daño neuronal y formación de lesiones, desarrollando un accidente cerebrovascular de sustancia blanca.

Comience colocando primero una pipeta de vidrio extraída en un tubo conectado a una línea de vacío. Inserte el extremo extraído en la solución de L-Nio o L-Nio más marcador fluorescente. Inicie el vacío y aplique succión hasta que se llenen al menos 2 milímetros de la parte de 0,5 milímetros de diámetro de la pipeta.

Deje la pipeta llena a un lado. Luego, coloque el ratón en un aparato estereotáctico equipado con un microscopio estereotáctico. Después de anestesiar y preparar al ratón para la cirugía de acuerdo con los procedimientos aprobados, verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. No debería haber respuesta.

A continuación, ajuste el brazo de inyección a 36 grados. Coloque un soporte de pipeta de vidrio extraído en el extremo distal de un sistema de inyección de presión de bajo volumen y conéctelo al brazo de inyección. Después de hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo de 1,5 centímetros para exponer el cráneo, seque la superficie del cráneo con un hisopo de algodón.

Luego, mientras mira a través de un microscopio estereotáctico con un aumento de 1 a 3X, use una herramienta de micro puntos para eliminar cualquier tejido perióstico suprayacente. Marque el bregma con un marcador de punta fina, luego use un taladro quirúrgico equipado con una broca quirúrgica de punta fina para perforar una craneotomía elíptica de 2 milímetros, comenzando posteriormente en el bregma y extendiéndose anteriormente justo a la izquierda de la línea media.

Retire los fragmentos óseos y el tejido blando suprayacente para que se pueda visualizar la corteza cerebral. Mantenga la superficie cortical húmeda aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril. A continuación, fije la pipeta llena al brazo del inyector. Alinee el extremo distal de la pipeta con bregma y ponga a cero las coordenadas estereotácticas.

Avance la pipeta hasta el primer punto de inyección utilizando las coordenadas laterales anterior, posterior y medial enumeradas en la tabla 1. Luego, avance la pipeta a la superficie cortical y ponga a cero la medición ventral dorsal. Baje lentamente la pipeta hasta la coordenada ventral dorsal.

Asegúrese de que el aumento del microscopio estereotáxico esté ajustado a 3X y que la retícula calibrada se pueda ver claramente. Mire la pipeta en ángulo desde un lado para que el menisco del fluido de aire tenga una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal de la pared interna y externa de la pipeta.

Ahora, usando un sistema de inyección de presión de bajo volumen, establecido a 20 PSI para pulsos de 20 milisegundos, inyecte 100 nanolitros de L-Nio en el cerebro. Después de inyectar el volumen total, espere 5 minutos para evitar el reflujo por la pista de la pipeta. A continuación, retire la pipeta y repita el procedimiento de inyección en el segundo y tercer conjunto de coordenadas que se indican en la tabla 1.

Después de la inyección final, retire la pipeta y coloque suficiente cera ósea para llenar el sitio de la craneotomía. Finalmente, aproximar los bordes de la herida del cuero cabelludo y unir con adhesivo dérmico.