Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:08 min. • July 8th, 2025
Tomemos la pared del cuerpo de las larvas de Drosophila, que consiste en músculos inervados por neuronas motoras para formar uniones neuromusculares o NMJ.
La membrana muscular postsináptica en la NMJ contiene proteínas unidas a la membrana que interactúan, que están marcadas con anticuerpos primarios.
Agregue sondas de ensayo de ligadura de proximidad, o PLA, que contengan anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos monocatenarios. Incubar para que las sondas se unan a los anticuerpos primarios.
Lave las sondas sueltas.
Incubar con tampón de ligadura que contenga oligonucleótidos conectores y enzimas ligasas.
La proximidad de las proteínas que interactúan facilita la unión del conector a las sondas. Luego, la ligasa sella los espacios, creando ADN circular.
Lave los conectores no unidos.
Incubar con una solución de amplificación que contenga polimerasa, que amplifica el ADN circular a través de la amplificación del círculo rodante.
Las sondas detectoras marcadas con fluoróforo en la solución se recocen al ADN amplificado y, tras la excitación, producen una señal fluorescente.
Monte la pared del cuerpo en un portaobjetos para visualizar las interacciones proteína-proteína marcadas con fluorescencia en el NMJ.
Para comenzar el ensayo, agregue una dilución de 1 a 5 en al menos 200 microlitros de volumen total de sonda PLA anti-ratón menos y sonda PLA anti-conejo más en BSA al 1% a las paredes del cuerpo. Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados.
Después de usar el tampón de lavado A para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante 5 minutos cada una, agregue una dilución de 1 a 40 de ligasa en solución de ligasa. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, use el tampón de lavado A para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante 2 minutos cada una antes de agregar una dilución de 1 a 80 de polimerasa en solución de amplificación. Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados.
Para preparar las muestras para la obtención de imágenes, use el tampón de lavado B para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante 10 minutos cada una. Luego use una dilución de 100 X del tampón de lavado B para hacer un lavado final durante 1 minuto. Equilibre las paredes de la carrocería en unas gotas de solución de montaje durante al menos 30 minutos.
Con fórceps finos, transfiera con cuidado las paredes del cuerpo a un tobogán de plataforma con las cutículas hacia abajo. Colóquelos en filas en la misma orientación dentro de una o dos gotas de la solución de montaje. Coloca un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros sobre la preparación, cuidando de no generar burbujas de aire. Luego, use esmalte de uñas transparente para sellar el portaobjetos.