Inmunohistoquímica de secciones de tejido cerebral de ratón para dirigirse a las neuronas de dopamina

Tome un portaobjetos recubierto de polímero con secciones de tejido cerebral de ratón que contengan neuronas de dopamina que expresen tirosina hidroxilasa, una enzima clave para la síntesis de dopamina.
Esboce las secciones con un bolígrafo hidrofóbico para garantizar una tinción uniforme.
Fije el tejido en una solución de acetona-metanol para preservar la morfología del tejido.
Enjuague con tampón que contenga detergente para permeabilizar las membranas celulares.
Incube con anticuerpos primarios dirigidos a la tirosina hidroxilasa en las neuronas de dopamina, luego lave para eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue anticuerpos secundarios marcados con colorante fluorescente, colorante nuclear e inhibidores de la ARNasa.
Durante la incubación, los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios, los colorantes nucleares marcan el núcleo y los inhibidores de la ARNasa inactivan las ARNasas.
Enjuague con tampón. Luego, deshidrate las secciones de tejido en concentraciones crecientes de etanol.
Incubar en xileno para limpiar el tejido.
Las secciones de tejido procesadas ahora están listas para la microdisección por captura láser, lo que permite una visualización y disección precisas de las neuronas dopaminérgicas objetivo.

Para llevar a cabo la inmunohistoquímica, use un bolígrafo hidrofóbico para delinear el tejido y dejar que se seque. Luego, en una solución de acetona metanol 1 a 1, fije el tejido a 20 grados centígrados negativos durante 10 minutos. Después de sacar el tejido del congelador, cubra las secciones con 100 a 200 microlitros de anticuerpo tirosina hidroxilasa en PBS y tritón al 1% durante 10 minutos.

Luego, use PBS con 1% de tritón para enjuagar los portaobjetos antes de cubrir las secciones con 100 a 200 microlitros de IgG anticonejo de cabra, etiquetados con Alexa Fluor 488. Incube durante cinco minutos y luego use PBS para enjuagar los portaobjetos dos veces. A continuación, deshidrate las muestras en una serie graduada de etanol libre de ARNasa durante 30 segundos cada una, como se demostró anteriormente en este video. Incubar en xileno, durante un minuto y un segundo lavado, durante cinco minutos. Retire las diapositivas inmediatamente antes de usarlas para LCM y déjelas secar al aire.