JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 5:13 min • April 28th, 2025
Tome una mosca de ojos blancos, transgénica, anestesiada y adaptada a la oscuridad.
La mosca expresa canales iónicos TRPL marcados con eGFP en los fotorreceptores del ojo.
En la oscuridad, TRPL se localiza en las membranas de los rabdómeros, las microvellosidades de los fotorreceptores.
Con aire comprimido, empuje la mosca de cabeza en la punta de una pipeta.
Recorta la punta y empuja la mosca hacia atrás.
Recórtalo de nuevo y empuja la mosca hacia adelante hasta que solo sobresalga su cabeza.
Inmovilice la punta en plastilina adherida a un portaobjetos y colóquela en una platina de microscopio de fluorescencia, con el ojo mirando radialmente hacia el objetivo del microscopio.
Agregue una gota de agua al objetivo, luego bájelo hasta que toque el ojo.
Captura imágenes de los fotorreceptores.
Mida las intensidades de fluorescencia en los rabdómeros, el cuerpo celular y el fondo.
Ilumina la mosca con luz naranja para inducir la translocación de TRPL al cuerpo celular.
Repita las mediciones de imágenes y fluorescencia.
Compare las imágenes para observar una fluorescencia rabdomeral reducida después de la iluminación, lo que indica la translocación de TRPL al cuerpo celular.
Para preparar una mosca en una variación no letal, transfiera la mosca anestesiada con hielo de cabeza a una punta de pipeta de 200 microlitros y empuje con cuidado la mosca hacia la punta con aire comprimido. Luego, con un bisturí, corte la punta de la pipeta justo delante de la cabeza. Y con unas pinzas, empuje con cuidado la mosca unos milímetros en la punta de la pipeta.
Vuelva a cortar la punta de la pipeta. Y empuje la mosca hacia la punta con el aire comprimido, de modo que solo la cabeza de la mosca sobresalga de la punta de la pipeta. Después de adherir un trozo de plastilina en un portaobjetos de objetos, presione la punta de la pipeta para que el ojo izquierdo o derecho mire hacia arriba. Asegúrese de que el ojo esté orientado correctamente bajo el microscopio. Para la adquisición de imágenes, seleccione un objetivo de inmersión en agua.
En el caso de una variación no letal, utilice una pipeta de laboratorio para adherir una gran gota de agua fría a la parte inferior del objetivo de inmersión en agua. Coloque con cuidado el portaobjetos con la mosca preparada en la platina del microscopio. Luego, baje el objetivo de inmersión en agua manualmente hasta que entre en contacto con la superficie del agua o el ojo de la mosca toque la gota.
Luego, cambie la trayectoria de la luz hacia la cámara del microscopio y genere una imagen en vivo. Reajustar el enfoque de la cámara y evaluar la orientación del ojo, considerando que el ojo debe mirar radialmente hacia el objetivo del microscopio. Utilice el software de tabla de búsqueda para detectar la sobresaturación.
En el caso de moscas no pigmentadas, ajuste el tiempo de exposición de modo que los píxeles más brillantes estén justo por debajo del límite de saturación para cada imagen. Grabe una imagen y guárdela como un archivo sin procesar para archivar todos los metadatos correspondientes de la grabación. Luego, exporte la imagen en un formato TIFF de puntos.
Para cuantificar la fluorescencia relativa de EGFP en los rabdomeros de micrografías de inmersión en agua, ajuste la configuración de ImageJ haciendo clic en Analizar. A continuación, establezca las medidas y marque solo la casilla del valor medio de gris. Importe la imagen TIFF de puntos haciendo clic en Archivo y luego en Abrir. Elija una región representativa de la imagen enfocada y amplíela al 200% o al 300% presionando repetidamente Control y Más juntos.
A continuación, seleccione la herramienta Ovalado. Y mientras presiona la tecla Shift, genere una selección circular en la imagen que sea significativamente más pequeña que un rabdómero fluorescente. Luego, busque el tamaño exacto que se muestra debajo de la barra de herramientas en la ventana principal de ImageJ. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de la selección circular, mueva el círculo al primer rabdómero con las teclas de flecha del teclado, haga clic en Analizar y, a continuación, en Medir.
Aparecerá una ventana de resultados que enumera el valor de gris medido. Continúe con las mediciones de rabdomeres 2 a 6 y también mida la señal de fondo. En el caso de moscas no pigmentadas, realice mediciones adicionales de las áreas correspondientes del cuerpo celular. Mida la fluorescencia de dos omatidios más, lo que da como resultado tres réplicas técnicas. Marque los omatidios analizados con la herramienta de lápiz y guarde esta imagen para documentarla.
Seleccione y copie los valores de gris medidos de la ventana de resultados y péguelos en el software de hoja de cálculo para realizar más cálculos. Ordene los valores de intensidad de fluorescencia según su origen en rabdómero, cuerpo celular y fondo de la categoría, y calcule la intensidad media de cada categoría. Luego calcule la cantidad relativa de EGFP presente en el rabdómero, utilizando la primera fórmula para ojos no pigmentados y la segunda para ojos pigmentados.