Detección de modificaciones de histonas en células de levadura con sobreexpresión de proteínas neurodegenerativas

Comience con una suspensión de células de levadura que sobreexpresan proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas.

Esta proteína sobreexpresada es responsable de las modificaciones en las proteínas o histonas que empaquetan el ADN con restos químicos.

Agregue hidróxido de sodio y beta-mercaptoetanol y luego incube en hielo.

El hidróxido de sodio y el beta-mercaptoetanol lisan las células, liberando las proteínas intracelulares, incluidas las histonas.

Centrifugar el lisado para recoger las proteínas. Deseche el sobrenadante.

Agregue un tinte de carga al gránulo de proteína y caliéntelo para desnaturalizarlo.

Cargue estas proteínas desnaturalizadas y un marcador de proteínas en el gel y el electroforeso para separarlas por tamaño.

Electrotransfiera las proteínas a una membrana, lave y agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica.

Agregue anticuerpos primarios que se unan específicamente a histonas modificadas.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos e incubar con anticuerpos secundarios fluorescentes, que se unen a los anticuerpos primarios.

Una banda fluorescente distinta confirma modificaciones de histonas, lo que indica una sobreexpresión de proteínas neurodegenerativas.

Para lisar las células para el análisis de Western blot, descongele los gránulos de células de levadura en hielo antes de volver a suspenderlos en 100 microlitros de agua destilada. Agregue 300 microlitros de hidróxido de sodio 0,2 molar y 20 microlitros de 2-mercaptoetanol a cada muestra celular. Y vuelva a suspender los gránulos mediante pipeteo.

Después de una incubación de 10 minutos en hielo, granular las células por centrifugación y volver a suspender las muestras en 100 microlitros de tinte de carga. Luego hierva las muestras durante 10 minutos en un bloque calefactor. Mientras se lisan las muestras, coloque dos geles en un soporte de gel y llene la cámara interior hasta la parte superior con tampón de corriente y la cámara exterior hasta la marca de línea de dos geles.

Cuando las muestras estén listas, cargue 15 microlitros de cada solución de lisis celular en cada pocillo del gel de poliacrilamida al 12% de 10 pocillos y agregue 5 microlitros de escalera de proteínas al pozo de la escalera de proteínas. Ejecute el gel durante aproximadamente 45 minutos a 150 voltios o hasta que el frente de tinte de carga llegue al fondo del gel.

Mientras el gel está funcionando, remoje dos almohadillas de fibra por gel en tampón de transferencia y una membrana de fluoruro de polivinilideno o PVDF por gel en metanol. Cuando el gel esté listo, enjuague la membrana y el tampón de transferencia. Y coloque una almohadilla de fibra previamente empapada en la parte inferior de una celda de aparato de transferencia semiseca, seguida de la membrana de PVDF, el gel y la segunda almohadilla de fibra previamente empapada.

Luego configure la potencia a 150 miliamperios durante 1 hora. Al final de la transferencia de proteínas, retire la membrana del aparato de transferencia para enjuagar brevemente con agua destilada. Coloque la proteína de membrana enjuagada hacia arriba en una pequeña caja de tinción y cubra la membrana con solución salina tamponada con Tris o tampón de bloqueo TBS durante una incubación de 1 hora a temperatura ambiente con un balanceo suave.

Al final de la incubación de bloqueo, incube la membrana durante la noche con una histona antilevadura y un anticuerpo específico de modificación en TBS a 4 grados Celsius, y un anticuerpo de control de carga nuclear adecuado.

A la mañana siguiente, lave la membrana cuatro veces en TBS, complementada con polisorbato 20 al 0,1% durante cinco minutos con balanceo a temperatura ambiente por lavado. Después del último lavado, incube la transferencia con los anticuerpos secundarios apropiados durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de cuatro lavados de 5 minutos en TBST y un lavado de cinco minutos en TBS solo con balanceo.

Luego, obtenga una imagen de la transferencia en un sistema de imágenes de Western Blot fluorescente durante 2 minutos.