Detección de modificaciones de histonas en células de levadura con sobreexpresión de proteínas neurodegenerativas

Comience con una suspensión de células de levadura que sobreexpresan proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas.

Esta proteína sobreexpresada es responsable de las modificaciones en las proteínas o histonas que empaquetan el ADN con restos químicos.

Agregue hidróxido de sodio y beta-mercaptoetanol y luego incube en hielo.

El hidróxido de sodio y el beta-mercaptoetanol lisan las células, liberando las proteínas intracelulares, incluidas las histonas.

Centrifugar el lisado para recoger las proteínas. Deseche el sobrenadante.

Agregue un tinte de carga al gránulo de proteína y caliéntelo para desnaturalizarlo.

Cargue estas proteínas desnaturalizadas y un marcador de proteínas en el gel y el electroforeso para separarlas por tamaño.

Electrotransfiera las proteínas a una membrana, lave y agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica.

Agregue anticuerpos primarios que se unan específicamente a histonas modificadas.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos e incubar con anticuerpos secundarios fluorescentes, que se unen a los anticuerpos primarios.

Una banda fluorescente distinta confirma modificaciones de histonas, lo que indica una sobreexpresión de proteínas