JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
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Comience con péptidos derivados de gránulos de neuromelanina (NMG) aislados del tejido cerebral humano postmortem.
NMGs, que se encuentran en las neuronas productoras de dopamina, contienen pigmento de neuromelanina, proteínas y lípidos.
Tome una columna de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que contenga una fase estacionaria a base de sílice funcionalizada con ligandos hidrofóbicos.
Carga los péptidos en la columna.
Los péptidos hidrófobos se unen más fuertemente a la columna que los hidrófilos.
Pase un búfer de elución a través de la columna.
Los péptidos menos hidrofóbicos eluyen primero, mientras que los más hidrófobos eluyen después.
Los péptidos eluidos ingresan a la fuente de ionización por electropulverización del espectrómetro de masas, donde se ionizan en iones peptídicos cargados.
Los péptidos ionizados ingresan al analizador de masas, donde se separan en función de sus relaciones masa-carga.
Un ion peptídico seleccionado se dirige a la celda de colisión y se fragmenta en iones más pequeños, cuyas relaciones masa-carga se miden nuevamente.
Finalmente, los datos se comparan con una base de datos de referencia para identificar las proteínas presentes en la muestra de NMG.
Después de realizar la digestión tríptica, como se describe en el texto, prepare la muestra para el análisis HPLC-MS disolviendo de 200 a 400 nanogramos de péptidos de muestra en un volumen definido de TFA al 0,1% en entradas de viales de vidrio espectrométrico de masas inertes. Si la determinación de la concentración no es aplicable debido a una cantidad baja de muestra, verifique la carga idéntica de la muestra comparando la corriente de iones total.
Para comenzar el análisis proteómico de datos sin procesar, haga clic en Cargar para cargar los archivos sin procesar en el software. Haga clic en Establecer experimento para asignar los nombres de muestra. Para definir parámetros específicos del grupo, agregue las modificaciones eligiendo Deamidación NQ, Oxidación M y Carbaminometilación N-Term como modificaciones variables. Y luego agregue carbaminometilación C como modificación fija. Elija tripsina como enzima de digestión en la pestaña de digestión.
En la pestaña Cuantificación sin etiquetas. Agregue la opción LFQ. Y si se van a procesar más de 10 archivos, elija la opción LFQ rápida para acortar el tiempo de procesamiento. Para asegurarse de que todos los demás parámetros específicos del grupo permanezcan en la configuración de fábrica, vaya a la pestaña Parámetros globales y agregue el archivo FASTA derivado de uniprot.org en la pestaña Secuencias. Modifique la regla de identificador en consecuencia y agregue el ID de taxonomía 9606 para Homo sapiens.
Para la cuantificación de proteínas, elija péptidos únicos y de cuchilla. A continuación, añada la opción iBAQ como medida para la cuantificación de proteínas en la pestaña Cuantificación sin etiquetas. Asegúrese de que todos los demás parámetros globales permanezcan en la configuración de fábrica y haga clic en Iniciar. Una vez que el análisis se haya realizado correctamente, recupere la salida de .txt del grupo de proteínas.