Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:01 min. • April 28th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples de fondo plano recubierta con una matriz de membrana basal, que contiene polímero extracelular y proteínas de adhesión que imitan la matriz del microambiente tumoral.
Introduzca un medio que contenga una neuroesfera de células de glioma derivadas de un tumor cerebral pediátrico, asegurándose de que esté posicionado en el centro del pocillo.
La matriz promueve la unión de la neuroesfera al pozo.
Agregue un reactivo supresor de fondo para minimizar la fluorescencia no específica.
A continuación, introduzca anticuerpos anti-CD44 conjugados con fluoróforos verdes.
Transfiera la placa a un sistema de imágenes de células vivas alojado dentro de una incubadora que mantiene las condiciones fisiológicas de la célula.
Con el tiempo, las células de glioma expresan la proteína de adhesión celular CD44, que interactúa con las proteínas de adhesión.
Esto activa la vía de señalización celular y facilita la migración celular desde la neurosfera.
Los anticuerpos anti-CD44 conjugados con fluoróforos se unen a los CD44 expresados en las células del glioma, haciéndolas fluorescentes.
La aparición de células fluorescentes verdes que se alejan de la neuroesfera confirma la migración de células de glioma.
Una vez que los pocillos estén recubiertos con BMM, corte una punta P200. Tome 50 microlitros del medio celular y NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo recubierto, plano y de fondo. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo. Agregue suavemente 50 microlitros del anticuerpo BSR y ALR diluido a cada pocillo, esperando de dos a tres minutos para que los reactivos se mezclen. Y usando un microscopio invertido, asegúrese de que la mayoría de los NS replicados estén ubicados en el centro del pozo. Después de asegurarse de la ausencia de burbujas, transfiera suavemente la placa al instrumento de análisis de células vivas como se demostró anteriormente.
En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción Programar para adquirir. Luego, haga clic en la pestaña más y seleccione Escanear según horario para escanear las placas con intervalos como se menciona en el manuscrito de texto. En la ventana del software, cree o restaure la embarcación y luego haga clic en la opción Nuevo. Seleccione el tipo de escaneo de clonación por dilución, el objetivo 4X y la fase y verde para el ensayo de migración. Seleccione el tipo de placa y defina los pocillos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de placas. Luego, configure la frecuencia de escaneo. Haga clic en Agregar a la programación e inicie el escaneo.