La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Este video muestra un procedimiento para separar ensamblajes virales mixtos en función de su composición de ácidos nucleicos. Esto permite el estudio de la diversidad taxonómica y el potencial funcional de ensamblajes virales complejos. Aquí, la hidroxiapatita, una forma cristalina de fosfato de calcio, se emplea en la separación de ácidos nucleicos.

Primero, se empaqueta una columna de hidroxiapatita y luego se aplican ácidos nucleicos virales purificados equilibrados a la columna, la interacción de carga entre los iones de calcio cargados positivamente de la hidroxiapatita y la columna vertebral de fosfato cargada negativamente de los subtipos de ácidos nucleicos une los ácidos nucleicos a la columna Nick. A continuación, se alude secuencialmente al ADN monocatenario, D-N-A-R-N-A y bicatenario con diferentes concentraciones de tampón de fosfato. A continuación, los ácidos nucleicos resultantes se desalan y se concentran en preparación para la visualización, cuantificación e identificación mediante secuenciación de ADN. La electroforesis en gel de agros confirma que las especies de ácidos nucleicos se pueden separar con menos del 9% de arrastre.

Así, este método permite evaluar la diversidad y la capacidad funcional de las comunidades virales. Hola, mi nombre es Doug Fro y soy investigador asociado en el laboratorio de la Dra. Shannon Williamson en el Instituto Craig Venture. Hoy les mostraré un procedimiento para separar el ADN monocatenario, el ADN bicatenario y el ARN de un ensamblaje viral ambiental.

Este método tiene ventajas sobre los métodos existentes, como el tratamiento con el núcleo, que se dirige al ADN o al ARN. La cromatografía de hidroxiapatita tiene la capacidad de capturar a toda la comunidad viral. Este método nos permite responder a varias preguntas en el campo de la ecología viral.

Por ejemplo, ¿cuál es el complemento genético total o la diversidad de la comunidad viral? La primera vez que pensamos en este método fue cuando quisimos estudiar todos los ensamblajes de plancton del río de la bahía de Chesapeake sin sacrificar un subconjunto de la firma genética. Las soluciones necesarias para este experimento deben prepararse con anticipación de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto, e incluyen tampón de fosfato 0,12 molar, tampón de fosfato 0,20 molar, tampón de fosfato 0,40 molar y una solución de fosfato molar.

Todo a pH 6,8 e hidroxiapatita hidratada el día del experimento, equilibre todos los tampones de fosfato y la hidroxiapatita hidratada colocándolos en un baño de agua a 60 grados centígrados. Comience este procedimiento preparando la columna econo que se utilizará para la separación de los ácidos nucleicos virales. Coloque una llave de paso en el extremo de la columna econo y asegúrese de que esté cerrada.

Con una pipeta, agregue agua desionizada a la columna, luego coloque la tapa en la parte superior de la columna e invierta repetidamente la columna para enjuagarla. Vierte el agua y repite este lavado varias veces. A continuación, retire la llave de paso de la columna económica y áutela en autoclave para esterilizarla.

La llave de paso no es autoclave ya que se derretirá. Enjuague la llave de paso con agua ionizada, luego nuevamente con etanol al 70% y deje que se seque al aire después del autoclave. Vuelva a colocar la llave de paso y ciérrela.

A continuación, trabajando en una campana extractora, agregue un mililitro de capa sigma a la columna y cubra el vidrio de la columna invirtiendo la columna con un movimiento de balanceo como se muestra aquí. El recubrimiento con una capa sigma minimizará la adherencia de los ácidos nucleicos a la superficie del vidrio. Durante la separación, se han recubierto las superficies de un vaso de sal.

Abra la llave de paso y decante en un tubo cónico. A continuación, para conectar la columna a un baño de agua circulante, use dos abrazaderas para sujetar la columna a un soporte de anillo. Conecte el tubo de silicona del baño de agua circulante, de modo que el flujo del agua del baño de agua sea de abajo hacia arriba.

Ajuste la temperatura a 60 grados centígrados e inicie la circulación. Mientras que en la práctica, la columna y la tubería estarían envueltas en un agente aislante, como papel de aluminio o aislamiento de tubería de espuma. Para minimizar la pérdida de calor, este paso no se muestra aquí.

Para visualizar mejor el procedimiento, cierre la llave de paso. Con una pipeta, agregue 10 mililitros de ARN estéril sin agua. Abra la llave de paso y deje que el agua se drene.

A continuación, vuelva a lavar después del segundo lavado. Enjuagar dos veces con 10 mililitros de tampón de fosfato 0,12 molar libre de ARN estériles y decantar entre lavados. La columna ya está lista para la cromatografía de hidroxiapatita.

Asegúrese de que la llave de paso de la columna económica esté cerrada. A continuación, utilizando una pipeta serológica estéril de dos mililitros, añada lentamente dos mililitros de hidroxiapetito rehidratado resuspendido preparado en la parte inferior de la columna. Vuelva a colocar la tapa de la columna.

Deje que el apetito hidroxi se asiente bajo la fuerza de la gravedad durante 30 minutos. Este método requiere atención al detalle. La columna de apetito hidroxi se procesa a una velocidad de 0,25 a 0,5 milésimas de pulgada por minuto.

Por lo tanto, es muy importante vigilar de cerca la columna para que no se seque. Una vez transcurridos 30 minutos, abra la llave de paso para drenar el tampón en un contenedor de residuos. Cierre la llave de paso y deseche el flujo.

Combine ácidos nucleicos con tampón de fosfato 0,12 molar en un volumen final de 500 microlitros e incube a 60 grados centígrados durante 10 minutos. Esto equilibrará los ácidos nucleicos a la temperatura de la columna y mejorará la separación de las diferentes especies de ácidos nucleicos al eliminar cualquier estructura secundaria que pueda estar presente. Con una pipeta serológica de dos mililitros, aplique rápidamente la solución de ácido nucleico al hidroxiapetito, asegurándose de no perturbar la columna.

Una vez que los 500 microlitros completos fluyen hacia la columna, se puede agregar una pequeña cantidad de tampón de fosfato 0,12 molar a la parte superior de la columna para evitar que se seque. Deje que los ácidos nucleicos se unan al apetito hidroxi durante 30 minutos. Después de la incubación de unión, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna.

A continuación, abra la llave de paso y recoja la muestra inicial de 500 microlitros, que contiene ADN monocatenario. Una vez que se hayan recogido 500 microlitros, cierre la llave de paso. A continuación, agregue seis mililitros de tampón de fosfato 0,12 molar al apetito hidroxilo, asegurándose de no perturbar la columna.

A continuación, abra la llave de paso y continúe recogiendo el flujo a través de la cinta que contiene ADN trenzado singlete en el mismo tubo de 15 mililitros del paso anterior. Después de haber recogido aproximadamente seis mililitros, cierre la llave de paso. Agregue un volumen de una solución de alcohol isoamílico de cloroformo fenol al tubo mezclado vigorosamente por vórtice, luego centrifugar a 3.500 veces G durante 15 minutos.

Después de la centrifugación, el tubo contendrá dos capas. Transfiera la capa superior de tolerancia, que contiene la cadena única de ADN, a un nuevo tubo de 15 mililitros, y almacene la muestra a temperatura ambiente para eluir y purificar el ARN Desde la columna, agregue seis mililitros de tampón de fosfato molar de 0,20 molares y recoja los flujos antes de usar un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, realice una extracción con cloroformo de fenol.

En cuanto a la muestra de ADN monocatenario, repita este proceso utilizando seis mililitros de tampón de fosfato 0,40 molar para eluir y purificar el ADN bicatenario de la columna. Por último, para despojar a la columna de cualquier residuo de ADN trenzado doblete. Repite este proceso una vez más.

Esta vez utilizando seis mililitros de tampón de fosfato molar 1.00 molar para desalar las muestras de ácido nucleico. Transfiera de cuatro a cinco mililitros de cada muestra a un dispositivo de filtro centrífugo Ultra four equipado con una muestra de concentrado de membrana ultracelular de corte de 30.000 pesos moleculares a menos de 500 microlitros girando a 6.000 GS a 30 grados Celsius durante unos cinco minutos en un rotor de ángulo fijo. Después de descartar el flujo, agregue el resto de las muestras al filtro.

Lleve el volumen a cuatro o cinco mililitros con ARN libres de un tampón XTE. A continuación, vuelve a girar hasta conseguir un volumen concentrado. Unos cinco minutos después del centrifugado, agregue de cuatro a cinco mililitros de ARN libre, un tampón XTE al filtro y concentrado.

Nuevamente, repita este lavado y cinco veces más para desalar completamente las muestras de ácido nucleico. Una vez que las muestras se hayan concentrado y desalado por completo, transfiera las muestras de ácido nucleico restantes a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitros. Precipite los ácidos nucleicos agregando una décima parte del volumen de acetato de sodio, dos volúmenes de etanol al 100% y un microlitro de azul glicogénico mezclado bien por centrífuga en vórtice.

A 28.000 GS cuatro grados centígrados. 60 minutos hasta Kent. Asegurándose de no alterar el pellet.

Agregue 300 microlitros de centrifugado de etanol al 70% a temperatura ambiente de 28, 000 GS durante 10 minutos para que no se pueda secar y vuelva a suspender cada fracción en un volumen adecuado de ARN. Se combinaron concentraciones iguales de tampón TE libre de los ácidos nucleicos virales M 13 MP 18, ADN monocatenario, MS dos monocatenarios, ARN FI seis bicatenarios, ARN y ADN bicatenario lambda, y luego se separaron mediante cromatografía de hidroxiapatita como se muestra en este video. Se combinaron concentraciones iguales de M 13, MP 18, ADN monocatenario, MS dos, monocatenario, ARN cinco, seis bicatenarios, ARN y ADN bicatenario Lambda, como se muestra en el carril seis, y se aplicaron a una columna de hidroxiapatita, como se puede ver aquí.

El D-N-A-R-N-A y el ADN bicatenario se aludieron de forma independiente a partir de la columna de hidroxiapatita utilizando tampón de fosfato de 0,12 molar, 0,18 molar, 0,40 molar y 1,00 molar. Se utilizó una escalera de un KB para confirmar el tamaño del genoma. Estos resultados indican que este método se puede utilizar para separar con éxito el ADN monocatenario, el ADN bicatenario y el ARN con menos del 9% de arrastre de una fracción a la siguiente.

Este método también se utilizó para separar ácidos nucleicos aislados de una comunidad viral dentro de la bahía de Chesapeake, como se muestra aquí. El D-N-A-R-N-A y el ADN bicatenario se aludieron de forma independiente utilizando concentraciones de tampón de fosfato de 0,12 molar, 0,20 molar y 0,40 molar, o 1,00 molar, respectivamente, se utilizaron una escalera de ADN de alta masa en el carril uno y una escalera KB en el carril dos para confirmar visualmente el peso molecular aproximado y la masa de los ácidos nucleicos, como se puede ver aquí, El ADN bicatenario fue el tipo de ácido nucleico dominante extraído del plancton Verio de la bahía de Chesapeake. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo separar los ácidos nucleicos de un ensamblaje viral mixto mediante cromatografía de hidroxiapatita.

Esto incluye la preparación de la columna de hidroxiapatita y los ácidos nucleicos, la separación e ilusión de los ácidos nucleicos utilizando varias concentraciones de tampón de fosfato y desalinización, y la concentración de los ácidos nucleicos después de la separación.