Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:38 min. • April 28th, 2025
Tome esferoides tumorales neuroendocrinos del intestino delgado en un tubo.
Agregue una solución fijadora para preservar las celdas.
Para lavar, centrifugar y reemplazar el fijador con tampón.
Centrifugar y desechar el sobrenadante para eliminar cualquier fijador restante.
Agregue un tampón que contenga detergente y un agente bloqueador para permeabilizar las membranas celulares y evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Lavar con tampón para eliminar el exceso de detergente y agente bloqueador.
Incubar con anticuerpos primarios, que se unen a la proteína diana específica de la célula neuroendocrina.
Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que se unan a los anticuerpos primarios.
Enjuague con tampón para eliminar el exceso de anticuerpos.
Agregue un medio de montaje que contenga un tinte para teñir el núcleo.
Transfiera los esferoides a una diapositiva y móntelos con un cubreobjetos.
Utilice un microscopio de fluorescencia para visualizar las células neuroendocrinas del esferoide que expresan proteínas específicas.
Arregle los organoides agregando 500 microlitros de paraformaldehído e incubándolos durante 15 minutos. Después de la incubación, lave el cultivo dos veces con 1 mililitro de PBS. Agregue 500 microlitros de PBS con 3% de BSA y 0,1% de Triton X-100 para permeabilizar el cultivo. Incube el tubo durante cinco minutos, luego lave los organoides tres veces con 1 mililitro de PBS y BSA al 3%.
A continuación, incube el cultivo con anticuerpos primarios durante una hora, luego repita los lavados con PBS y BSA. Incubar con los anticuerpos secundarios y repetir los lavados, asegurándose de aspirar y desechar todo el sobrenadante.
Para obtener imágenes de los esferoides, agregue 5 microlitros de medio de montaje que contenga DAPI y use una pipeta P20 para transferir 5 microlitros de los esferoides a un portaobjetos de vidrio. Selle el portaobjetos con un cubreobjetos y obtenga imágenes con un microscopio de fluorescencia utilizando los objetivos de 10, 20 y 40 veces.